PepN-like aminopeptidase from Lactohacillus curvatus DPC2024: purification and characterization

Abstract - An enzyme with a PepN-like aminopeptidase activity was purified 127-fold with 4.3 % recovery from a cell-free extract of Lactohacillus curmius DPC2024, a component of the non-starter lactic acid bacterial flora of Cheddar cheese. The purified enzyme exhibited maximum activity on leucyl-p-nitroanilide (Leu-pNA) at pH 7.0 and 40 °C. The enzyme had a molecular mass of ~98 kDa as estimated by gel permeation chromatography, and showed one band corresponding to a molecular mass of ~95 kDa on sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), indicating that the native enzyme existed as a monomer. The aminopeptidase appeared to be a met-alloenzyme since it was strongly inhibited by ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and o-phenanthroline at 0.1 mmol.L^-' concentration and was partially reactivated by Zn²⁺ and Co²⁺. The enzyme was also partially inhibited by p-chloromercuribenzoate and iodoacetic acid, suggesting the involvement of sulphydryl groups in the reaction mechanism. The enzyme had abroad substrate specificity, hydrolysing a number of p-nitroanilide derivatives of amino acids and peptides and di-, tri-, tetra- and pentapeptides. The N-terminal amino acid sequence of the first 20 amino acid residues was determined (AELMRFYQSFQPEHYQVFLD), and showed 40-55 % homology with Zn²⁺-dependent aminopep-tidases from Streptococctis thermophilus NCD053, Ixictobacillus delbrueckii subsp. lactis DSM7290, Lactococcus lactis subsp. lactis MG1363 and Lactococcus lactis subsp. cremoris Wg2. © Inra / Elsevier. Paris.

Résumé - Aminopeptidase de type PepN de Lactohacillus curvatus DPC2024 : purification et caractérisat ion
Une enzyme avec une activité aminopeptidasique de type PepN a été purifiée 127 fois avec un taux de récupération de 4,3 % à partir d'un extrait sans cellule de Lactohacillus curvatus DPC 2024, un composant de la flore lactique non-levain du cheddar. L'enzyme purifiée possède une activité maximale sur le substrat leucyl-p-nitroanilide (Leu-pNA) à pH 7.0 et à 40 °C. La masse moléculaire de l'enzyme, déterminée par chromatographie d'exclusion par la taille, est de ~98 kDa. Par SDS-PAGE, une bande correspondant à une masse moléculaire de ~95 kDa a été mise en évidence, indiquant que l'enzyme native existe sous forme de monomère. Cette aminopeptidase semble être une métalloenzyme car elle est fortement inhibée par 1"EDTA et l'o-phenanthroline à la concentration de 0,1 mmol.L^-1 et est partiellement réactivée par Zn²⁺ et Co²⁺. L'enzyme est aussi partiellement inhibée par le p-chloromereuribenzoate et l'acide iodoacélique, suggérant l'implication de groupements sulfydryle dans le mécanisme de la réaction. L'enzyme a une large spécificité de substrat, hydrolysant un certain nombre d'acides aminés, de peptides, di-, tri-, tetra- et pentapeptides dérivés du p-nitroanilide. Les 20 premiers acides aminés de la séquence N terminale ont été identifiés (AELMRFYQSFQPEHYQVFLD). Une homologie de 40-55 % avec l'aminopeptidase Zn²⁺ dépendante des Streptococcus thermophilus NCD053, Luciobacillus delbrueckii subsp. lattis DSM7290, Lactococcus lactis subsp. lattis MG1363 et Lactococcus lattis subsp. cremoris Wg2. a été observée. © Inra / Elsevier, Paris.