Partial purification and characterization of intracellular proteinases from Lactococcus lactis subsp lactis MG1363

Abstract - Three caseinolytic proteinases (P1, P2, P3) were isolated from the cytoplasm of plasmid-free Lactococcus lactis subsp lactis MG1363 by sequential chromatography on DEAE-cellulose, Sephacryl 200, CM-cellulose, Phenyl Sepharose or hydroxyapatite and MonoQ ion exchanger. Minor caseinolytic fractions were separated during successive purification steps and the final preparations, although free from aminopeptidase activities, showed impurities by sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), indicating autolysis or a very complex caseinolytic system. Proteinase P1 was a dimer with molecular mass (M_s) of ca 66 kDa by SDS-PAGE and 124 kDa by gel filtration and it was most sensitive to EDTA. Proteinase P2 (M_s ca 68 kDa by SDS-PAGE and 64 kDa by gel filtration) and P3 (M_s ca 52 kDa SDS-PAGE and 47 kDa by gel filtration) were strongly inhibited by phenylmethylsulfonyl fluoride. Proteinase P1 was most active at pH 7.0 and 35 °C, while proteinases P2 and P3 had optima at pH 7.5 and 45 °C. Urea-PAGE of digests of - or -casein showed differences in the peptide pattern released by the three proteinases after 6 or 20 h incubation. The peptides released by P1, P2 and P3 were also different from those produced by a crude preparation of the cell envelope-associated proteinase from L lactis subsp lactis 712, the parental strain of L lactis subsp lactis MG1363. Reverse-phase fast protein liquid chromatography also showed differences between peptides released from _s1-casein by P1, P2 and P3.

Résumé - Purification partielle et caractérisation de protéinases intracellulaires de Lactococcus lactis ssp lactis MG 1363
Trois protéinases caséolytiques (P1, P2, P3) ont été isolées du cytoplasme sans plasmide de Lactococcus lactis ssp lactis MG 1363par chromatographie séquentielle sur cellulose DEAE, Sephacryl 200, CM-cellulose, Phenyl Sepharose ou hydroxyapatite et échange d'ions MonoQ. Les fractions caséinolytiques mineures ont été séparées lors de ces étapes de purification successives, puis les préparations finales, bien que sans activité aminopeptidasique, ont montré des impuretés par SDS-PAGE, indiquant une autolyse ou un système caséolytique très complexe. La protéinase P1 était un dimère (masse moléculaire d'environ 66 kDa par SDS PAGE et 124 kDa par gel filtration) et elle était la plus sensible à l'EDTA. Les protéinases P2 (masse moléculaire d'environ 68 kDa par SDS PAGE et 64 kDa par gel filtration) et P3 (masse moléculaire d'environ 52 kDa par SDS PAGE et 47 kDa par gel filtration) étaient fortement inhibées par du phényl méthyl sulfonyl fluorure. La protéinase P1 était plus active à pH 7,0 et 35 °C, tandis que les protéinases P2 et P3 avaient un optimum à pH 7,5 et 45 °C. L'électrophorèse urée PAGE d'hydrolysats des caséines t a montré des différences dans le profil peptidique libéré par les trois protéinases après 6 ou 20 heures d'incubation. Les peptides relargués par P1, P2 et P3 étaient également différents de ceux produits par une préparation brute de protéinases associées à l'enveloppe cellulaire de L lactis ssp lactis MG 712, issu de L lactis ssp lactis MG1363. La chromatographie RP-FPLC a également montré des différences entre les peptides libérés à partir de la caséine _s1 par P1, P2 et P3.