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Issue |
Lait
Volume 80, Number 4, July-August 2000
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Page(s) | 385 - 396 | |
DOI | https://doi.org/10.1051/lait:2000133 |
DOI: 10.1051/lait:2000133
Lait 80 (2000) 385-396
Purification and characterization of an X-prolyl-dipeptidyl aminopeptidase from Lactobacillus curvatus DPC2024
Abdallah A.A. Magboul - Paul L.H. McSweeney
Food Science and Technology Department, University College, Cork, Ireland
(
Abstract:
An X-prolyl-dipeptidyl aminopeptidase (PepX) was purified
-fold from the cell-free extract of
Lactobacillus curvatus DPC2024. The native enzyme appeared to be a dimer with a subunit molecular
mass of
kDa as determined by sodium dodecyl sulphate gel electrophoresis. Optimal activity of
the purified enzyme on Ala-Pro-p-nitroanilide (pNA) was at pH 7.5 and 45
C. The enzyme retained
more than 60% of its activity after pre-incubation for 30 min at 45
C but the activity decreased
sharply following pre-incubation at temperatures above 45
C. The enzyme was activated by
Co2+, Mn2+, Ni2+ at 0.1 and 1.0 mmol.L-1 and by Cu2+, Cd2+ and Zn2+ at
0.1 mmol.L-1 but it was strongly inhibited by 1.0 mmol.L-1 phenylmethylsulphonyl fluoride,
Hg2+, Cu2+, Cd2+ and Zn2+ and partially by ethylenediaminetetraacetic acid,
o-phenanthroline and p-chloromercuribenzoate. The enzyme hydrolysed Ala-Pro-pNA, Arg-Pro-pNA,
Gly-Pro-Arg, Val-Pro-Leu at a faster rate and slowly hydrolysed Ala-Ala-pNA but it was not active on
Ala-Ala-Ala, Ala-Leu-Ala, Pro-Pro-Pro, Arg-Pro-Pro, dipeptides and N-terminally blocked p-nitroanilide
derivatives and other peptides. The sequence of the first 20 amino acid residues was determined and showed
40% homology to X-prolyl-dipeptidyl aminopeptidases from Lactobacillus helveticus CNRZ 32,
Lactobacillus helveticus 53/7, Lactococcus lactis ssp. cremoris P8-2-47 and
Lactococcus lactis ssp. lactis NCDO 763 and 35% homology to a PepX from Lactobacillus
delbrueckii ssp. lactis DSM 7290.





Keywords:
Lactobacillus curvatus / X-prolyl-dipeptidyl aminopeptidase / purification
Résumé:
Purification et caractérisation d'une X-prolyl-dipeptidyl aminopeptidase isolée à
partir de Lactobacillus curvatus DPC2024. Une X-prolyl-dipeptidyl aminopeptidase (pepX) a été
purifiée environ 176 fois à partir d'un extrait intracellulaire de Lactobacillus curvatus DPC2024.
L'enzyme native est apparue être de la forme dimère avec des sous-unités de masse moléculaire
kDa déterminée par électrophorèse SDS-PAGE. L'activité optimale de l'enzyme purifiée,
déterminée sur le fragment Ala-Pro-p-nitroanilide (pNA), a été obtenue à pH 7,5 et à 45
C.
L'enzyme a conservé plus de 60 % de son activité après une pré-incubation de 30 min à 45
C mais
cette activité a diminué brutalement après pré-incubation à des températures supérieures à 45
C.
L'enzyme a eu son activité augmentée par une concentration de 0,1 et 1,0 mmol.L-1 en Co2+,
Mn2+, Ni2+ mais a été inhibée fortement par une concentration de 1,0 mmol.L-1 en
phénylméthylsulfonyl fluoride et en Hg2+, Cu2+, Cd2+ et Zn2+ et partiellement inhibée
par l'acide éthylènediaminetétraacétique, la o-phénanthroline et le p-chloromercuribenzoate. L'enzyme
a hydrolysé les fragments Ala-Pro-pNA, Arg-Pro-pNA, Gly-Pro-Arg, Val-Pro-Leu à une vitesse plus élevée et
le fragment Ala-Ala-pNA à vitesse lente mais n'a pas été active sur les fragments Ala-Ala-Ala,
Pro-Pro-Pro, Arg-Pro-Pro, les dipeptides, les peptides et les dérivés de p-nitroanilide bloqués du côté
N-terminal. La séquence des 20 premiers acides aminés a été déterminée et a révélé 40 % d'homologie avec
les X-prolyl-dipeptidyl aminopeptidases de Lactobacillus helveticus CNRZ32, Lactobacillus
helveticus 53/7 et Lactobacillus lactis ssp. lactis NCDO 763, 35 % d'homologie avec la PepX
de Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis DSM 7290.




Mots clé :
Lactobacillus curvatus / X-prolyl-dipeptidyl aminopeptidase / purification
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