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Volume 77, Number 1, 1997
IDF Symposium " Ripening and Quality of Cheeses ".
Page(s) 169 - 180
Lait 77 (1997) 169-180
DOI: 10.1051/lait:1997111

Purification and characterisation of an intracellular aminopeptidase from Brevibacterium linens ATCC 9174

F.P. Rattray and P.F. Fox

Department of Food Chemistry, University College. Cork, Ireland

Abstract - An intracellular aminopeptidase from Brevibacterium linens ATCC 9174 was purified 4300-fold to homogeneity using ammonium sulphate fractionation, anion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography and anion exchange chromatography. The pH and temperature optima were 8.5 and 35°C, respectively. The purified aminopeptidase was stable over the range pH 8 to 10, and was thermally stable up to 20°C at pH 8.5. The molecular mass of the enzyme was found to be 59 kDa by SDS-PAGE and 69 kDa by gel filtration, indicating that the native enzyme exists as a monomer. The aminopeptidase was strongly inhibited by the thiol blocking agent, ρ-hydroxymercuribenzoate, and by Co2+ and Zn2+; activity was unaffected by metal chelators, reducing agents or phenylmethylsulphonyl fluoride. Km and kcat values for L-Ala-ρ-NA were 3.3 mmol / L and 4.3 s-1, respectively, while the corresponding values for L -Gly-ρ-NA were 0.2 mmol / L and 7.6 s-1, respectively. The aminopeptidase hydrolysed dipeptides with an alanine residue at the N-terminal but tripeptides were not hydrolysed. The sequence of the first 19 N-terminal amino acids was NH2-Pro-Phe-Asp-Gly-Pro-Asp-Thr-Ala-Ala-Ile-Ile-Asp-Arg-Leu-?-Asn-Ala-?-Thr.

Résumé - Purification et caractérisation d'une aminopeptidase intracellulaire de Brevibacterium linens ATCC 9174
Une aminopeptidase intracellulaire de Brevibacterium linens ATCC 9174 a été purifiée 4300 fois par homogénéisation et fractionnement au sulphate d'ammonium, chromatographie d'échange d'anions, chromatographie par interactions hydrophobes et chromatographie d'échange d'anions. Le pH et la température optimale étaient respectivement de 8,5 et 35 °C. L'aminopeptidase était stable, de pH 8 à 10. De plus, elle était stable thermiquement à 20 °C à pH 8,5. La masse moléculaire de l'enzyme, déterminée par SDS-PAGE et filtration sur gel était respectivement de 59 kDa et 69 kDa, ce qui indique que l'enzyme native existe sous forme de monomère. L'activité enzymatique est fortement inhibée par l'agent bloquant les groupements thiols, le ρ -hydroxymercuribenzoate, et par les ions Co2+ et Zn2+: l'activité enzymatique n'est pas inhibée par les chélateurs de métal, les agents réducteurs ou le fluorure de phenylmethylsulphonyle. Les valeurs Km et kcat pour le L -Ala-p-NA étaient respectivement de 3,3 mmol / L et 4,3 s-1, tandis que les valeurs correspondantes pour L-Gly-ρ-NA étaient respectivement 0,2 mmol / L et 7,6 s-1. L'aminopeptidase hydrolysait les dipeptides possédant un résidu alanine en N-terminal mais les tripeptides n'étaient pas hydrolysés. L'ordre des 19 premiers acides aminés N-terminaux était NH2-Pro-Phe-Asp-Gly-Pro-Asp-Thr-Ala-Ala-Ile-Ile-Asp-Arg-Leu-?-Asn-Ala-?-Thr.

Key words: aminopeptidase / Brevibacterium linens / cheese / purification

Mots clés : aminopeptidase / Brevibacterium linens / fromage / purification