Lait 78 (1998) 471-489
DOI: 10.1051/lait:1998545

Preferential sites of tryptic cleavage on the major bovine caseins within the micelle

Valérie Gagnaire and Joëlle Léonil

Laboratoire de recherche de technologie laitière. Inra. 65, rue de St-Brieuc, 35042 Rennes cedex, France

(Received 9 July 1997; accepted 15 April 1998)

Abstract - Caseins, major proteins in bovine milk, are structured in micelles within which the detailed casein organisation remains unclear. We have used limited proteolysis to find the most exposed regions of the caseins within the micelle. Under hydrolysis conditions, only 9% of colloidal calcium and 15.6% of the colloidal inorganic phosphate were removed from the micelle after4 h. The released peptides during tryptic hydrolysis were separated from the residual micelle by ultracentrifugation. They were subsequently analysed and characterised by reversed-phase HPLC coupled online with electrospray ion source mass spectrometry (ESI-MS). After 4 h of hydrolysis, the β-casein had completely disappeared while about 40% of α-casein and 37% of κ-casein remained undigested. The initial distribution, i.e., 91% caseins and 9% peptides prior to hydrolysis, was modified after hydrolysis to give 64% peptides remaining within the micelles together with 13% caseins and 22% of the peptides produced were released from the micelles. Among the 61 peptides identified, 34 arose from β-casein, 16 from α_s1-casein, 11 from α_s2-casein and none from κ-casein. For the latter casein, the failure to detect peptides was due to its lower concentration in the large micelles com-pared with that of the β and α_s1-caseins. The peptides derived from β-casein were mainly released from the micelle, while peptides from both α_s1,- and α_s2-caseins were preferentially retained within the residual micelles, suggesting that all the caseins are accessible to trypsin but are differentially involved in the micellar framework. Our results suggest that α_s-caseins play a significant role in the micellar cohesion via salt binding with colloidal calcium phosphate and hydrophobic interaction, with itself and with the other caseins. © Inra / Elsevier, Paris.

Résumé - Sites privilégiés de coupure sur les caséines bovines majeures par trypsinolyse des micelles
Les caséines, constituants majeurs des protéines du lait de vache, sont présentes sous forme de micelles dont l'organisation interne est encore mal connue. Nous avons utilisé la protéolyse limitée pour déterminer les régions des caséines les plus accessibles au sein de la micelle. Dans les conditions utilisées, seuls 9 % du calcium colloïdal et 15,6 % du phosphate inorganique colloïdal sont éliminés de la micelle après 4 h d'hydrolyse. Afin de différencier les peptides qui sont libérés de la micelle de caséine au cours de l'hydrolyse par la trypsine de ceux qui restent situés à l'intérieur, nous avons ultracentrifugé les hydrolysats avant de caractériser les peptides. Leur caractérisation était ensuite réalisée par couplage direct entre la CLHP de phase inverse et la spectrométrie de masse à source d'ionisation electrospray. Après 4 h d'hydrolyse, la caséine β avait complètement disparu tandis qu'il restait encore 40 % de caséine α_s1| et 37 % de caséine κ non dégradées. La répartition des composés azotés au sein de la micelle est passée d'une composition initiale de 91 % de caséines et de 9 % de peptides à 13 % de caséines et 64 % de peptides après hydrolyse, alors que seulement 22 % des peptides produits étaient libérés de la micelle. Parmi les 61 peptides identifiés, 34 provenaient de la caséine p, 16 de la caséine α_s1, 11 de la caséine α_s2, et aucun de la caséine κ. Pour cette dernière, sa plus faible concentration dans les grosses micelles comparée à celle des caséines βet α_s1 ne nous a pas permis de les détecter. Les peptides issus de la caséine β étaient presque tous libérés dans la solution tandis que ceux provenant des caséines α_s1 et α_s2 étaient majoritairement retrouvés dans les micelles résiduelles. Ceci suggère que tous les types de caséines sont accessibles à la trypsine mais que leur rôle dans l'assemblage micellaire serait différent. Ainsi, les caséines α_s participeraient de manière significative à la cohésion micellaire en faisant intervenir des liaisons salines avec le phosphate de calcium colloïdal et des interactions intermoléculaires hydrophobes avec elle-même et avec les autres caséines. © Inra / Elsevier, Paris.

Key words: casein / micelle / limited proteolysis / trypsin / reversed-phase chromatography / mass spectrometry / peptide / accessibility

Mots clés : caséine / micelle / protéolyse limitée / trypsine / chromatographie de phase inverse / spectrométrie de masse / peptide / accessibilité

Corresponding author: Joëlle Léonil jleonil@labtechno.roazhon.inra.fr