Lait 75 (1995) 345-365
DOI: 10.1051/lait:19954-526

Autolysis of dairy propionibacteria: isolation and renaturing gel electrophoresis of the autolysins of Propionibacterium freudenreichii CNRZ 725

R. Lemée^a, S. Lortal^a and J. Van Heijenoort<sup>b

a</sup>  Laboratoire de recherches de technologie laitière, INRA, 65, rue de Saint-Brieuc, 35042 Rennes cedex
^b  Centre national de la recherche scientifique. Unité de recherche associée 1131, Université Paris-Sud, 91405 Orsay, France

Abstract - Dairy propionibacteria contribute to proteolysis and lipolysis of the curd in Swiss-type cheese technology by their autolysis and the concomitant release of intracellular enzymes such as esterases and peptidases. The spontaneous autolysis of P freudenreichii CNRZ 725 just after maximal growth in sodium lactate broth was shown to occur at pH 6.0-6.2, when the main carbon source (lactate) was depleted. This spontaneous autolysis was also observed with 6 other strains of P freudenreichii, and its extent as well as its rate were clearly strain-dependent. The cell walls of P freudenreichii CNRZ 725 were isolated by mechanical disruption and suspended in 0.05 mol / L potassium chloride at 40°C. As they contained active autolysins, rapid cell wall lysis was observed in these conditions. Concomitantly, 15% of the cell wall proteins were released in the supernatant, as well as a high amount of neutral polysaccharides. The presence of autolysins among the released proteins was demonstrated by the lytic activity of the supernatant, and by renaturing gel electrophoresis. This method, applied here for the first time to analyse the autolysins of propionibacteria, revealed the complexity of their autolytic system. In P freudenreichii CNRZ 725, at least 8 lytic activities of various intensifies and apparent molecular masses were observed: the most intense at 121 kDa, 6 very close activities between 81 and 118 kDa and a rather weak and not completely translucent one at 34 kDa. Interestingly, ail these activities were observed when the gels were incubated in Emmental juice instead of the optimal renaturation buffer (0.1 mol / L potassium phosphate buffer pH 5.8, 1% w / v of Triton X-100). Attempts made to separate and tentatively purify by chromatography (gel filtration, anion exchange) these 8 lytic activities from the supernatant of cell wall lysis were all unsuccessful. Finally, a method for extracting directly autolysins from whole cells was developed, using 1 mol / L LiCl solution. This LiCl treatment led to a crude extract of autolysins with a low content of contaminating neutral polysaccharides; how-ever, the 34 kDa lytic activity was seemingly missing in this extract.

Résumé - Autolyse des bactéries propioniques laitières : isolement et analyse sur gel d'acry-lamide des autolysines de Propionibacterium freudenreichii CNRZ 725
Les bactéries propioniques laitières interviendraient dans la protéolyse et la lipolyse des fromages à pâte pressée cuite après libération de leurs enzymes intracellulaires, par autolyse bactérienne. Dans un milieu de culture YEL, la phase d'autolyse spontanée de P freudenreichii CNRZ 725 débutant juste après la phase de croissance maximale, a lieu lorsque le pH du milieu de culture atteint 6,0-6,2 et que la principale source carbonée (lactate) est épuisée. L'ampleur de cette autolyse spontanée, également observée au cours de la croissance de 6 autres souches de P freudenreichii, est un caractère souche-dépendant. Des parois de P freudenreichii CNRZ 725 préparées par rupture mécanique des cellules à la presse de French, sont placées dans une solution de chlorure de potassium à 0,05 mol / L, à 40°C. Dans ces conditions, les autolysines associées à ces parois et encore dotées de leur activité, provoquent une hydrolyse pariétale rapide. Lors de cette hydrolyse 15% des protéines pariétales sont libérées dans le surnageant parallèlement à d'importantes quantités de polysaccharides neutres pariétaux. Parmi ces protéines libérées, la présence d'autolysines a été mise en évidence par mesure de l'activité lytique du surnageant et par analyse sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) après renaturation des enzymes en présence de Triton X-100. Cette méthode, utilisée pour la première fois pour l'analyse des autolysines des bactéries propioniques, révèle la complexité de leur système autolytique. Chez P freudenreichii CNRZ 725, 8 activités lytiques d'intensité et de masses moléculaires apparentes variables ont été mises en évidence : une activité très intense de 121 kDa ; 6 activités regroupées entre 81 et 118 kDa, et une activité plus diffuse et jamais totalement translucide de 34 kDa. De manière très intéressante, toutes ces activités sont observées lorsque le gel de polyacrylamide est directement incubé dans du jus d'emmental au lieu d'utiliser la solution de renaturation optimale (tampon phosphate de potassium à 0,1 mol / L, pH 5,8, à 40°FC, additionné de 1% (p / v) de Triton X-100). Les tentatives de séparation et de purification par chromatographie (filtration sur gel et échangeur d'anions) de ces 8 activités lytiques isolées du surnageant d'hydrolyse pariétale sont restées vaines. Néanmoins, une méthode d'extraction des autolysines directement des cellules entières, a été développée par l'utilisation d'une solution de LiCI à 1 mol / L. Ce traitement permet l'obtention d'un extrait brut d'autolysines pauvre en polysaccharides neutres. Mais l'activité de 34 kDa est absente de cet extrait.

Key words: propionibacteria / autolysis / autolysin / renaturing SDS-PAGE / cell wall

Mots clés : bactérie propionique / autolyse / autolysine / SDS-PAGE suivie d'une renaturation / paroi

Corresponding author: S Lortal lortal@labtechno.roazhon.inra.fr