Lait 74 (1994) 333-341
DOI: 10.1051/lait:1994528

Proteolysis of bovine β-casein by a plasmin-Sepharose conjugate

M. Benali^a, E. Guilbaud^a, P. Montagne^{a, b}, G. Humbert^c, M.L. Cuillière^{a, d}, J. Duheille^a, G. Faure^a and G. Linden<sup>c

a</sup>  Immunology Laboratory, BP 184, F-54505 Vandoeuvre-lès-Nancy, Cedex
^b  Inserm
^c  Laboratory of Applied Biochemistry, associated with INRA, BP 239, F-54506 Vandoeuvre-lès-Nancy Cedex, France
^d  CNRS

(Received 1 April 1994; accepted 11 July 1994)

Abstract - A plasmin-Sepharose conjugate (5.7 mg of active plasmin / g gel) was prepared by covalent immobilization of bovine plasmin (EC 3.4.21.7) on activated CH-Sepharose 4B, with formation of amide bonds between primary amino groups of plasmin and carboxyl-activated functions anchored to the gel. A strong decrease (60%) of the proteolytic activity of plasmin for a chromogenic substrate was observed during dialysis performed before immobilization. However, a high binding yield and a good preservation of the proteolytic activity of immobilized enzyme (95%) were then observed. The reactivity of free and immobilized plasmin with bovine β-casein (β-CN) were compared. Kinetic study of β-CN proteolysis indicated a perceptible loss of enzyme activity in plasmin-Sepharose conjugate compared to free plasmin (V_max = 3.8 10^-2 and 53.5 10^-2 OD unit / min, K_m = 1.2 10^-4 et 6.2 10^-4 mol / l, respectively). Electrophoretic study of the reaction mixtures showed that the proteolysis of β-CN f( 1-105 / 7) by immobilized or free plasmin, producing β-CN f(29-105 / 7), succeeds the reaction of the whole β-CN. Microparticle-enhanced nephelometric immunoassay of residual β-CN, performed in reaction supernatants, indicated there is no significant influence of β-CN fragments (β-CN f(1-105 / 7) and mixture of C-terminal peptides β-CN (29-209), (106-209), (108-209)) on the proteolysis of the whole β-CN. As already observed for other proteases, an alteration of the enzyme charge during the immobilization pro-cess might be the cause of the slight modification of the catalytic activity observed in plasmin-conjugate.

Résumé - Protéolyse de la caséine β bovine par un conjugué plasmine-sepharose
Un conjugué plasmine-sepharose (5,7 mg de plasmine active / g de gel) est obtenu par immobilisation de la plasmine bovine (EC 3.4.21.7) sur du CH-sepharose 4B. Le couplage s'effectue par formation de liaisons amides entre les fonctions aminés primaires de l'enzyme et les groupes carboxyles activés du gel. La dialyse de la plasmine avant couplage provoque une perte importante (60%) de l'activité protéolytique pour un substrat synthétique. Cette activité et en revanche bien conservée (95%) lors de l'immobilisation de l'enzyme. La réactivité du conjugué avec la caséine β (β-CN) bovine est comparée à celle de la plasmine libre. L'étude cinétique de la protéolyse de la β-CN indique une diminution de l'activité de l'enzyme immobilisée par rapport à celle de la plasmine libre (V_max = 3,8 10^-2 et 53,5 10^-2 unité DO / min, K_m = 1,2 10^-4 et 6,2 10^-4 mol / l, respectivement). L'étude électrophorétique des milieux de réaction montre que, comme avec l'enzyme libre, la protéolyse de la β-CN entière par l'enzyme immobilisée est suivie de celle du fragment β-CN (1-105 / 7) qui libère le fragment β-CN (29-105 / 7). Le dosage de la β-CN résiduelle dans les surnageants de réaction est réalisé par immunonéphélémétrie microparticulaire. Il indique qu'il n'existe aucun effet inhibiteur mesurable des fragments de la β-CN (β-CN f(1-105 / 7) et mélange des fragments C-terminaux β-CN (29-209), (106-209), (108-209)) sur la protéolyse de la molécule entière par les plasmines libre et immobilisée. Comme pour d'autres protéases, une altération de la charge de l'enzyme, consécutive à son immobilisation, pourrait être responsable de la diminution de l'activité catalytique observée dans le conjugué plasmine-sepharose.

Key words: immobilized enzyme / proteolysis / plasmin / β-casein

Mots clés : enzyme immobilisée / protéolyse / plasmine / caséine β