Lait 84 (2004) 169-178
DOI: 10.1051/lait:2003046

Le potentiel de la TTGE pour l'étude bactérienne de quelques laits crus

Véronique Lafarge^a, Jean-Claude Ogier^b, Victoria Girard^a, Véronique Maladen^a, Jean-Yves Leveau^c and Agnès Delacroix-Buchet<sup>b

a</sup>  Laboratoire d'études et de Recherches en Hygiène et Qualité des Aliments, AFSSA, 39-41 rue du 11 novembre 1918, 94700 Maisons-Alfort, France
^b  Unité de Recherches Laitières et Génétique Appliquée, INRA, Domaine de Vilvert, 78352 Jouy-en-Josas Cedex, France
^c  Laboratoire de Microbiologie Industrielle, ENSIAA, 1 avenue des Olympiades, 91744 Massy Cedex, France

Abstract
Potential of TTGE for the bacterial study of several raw milks. Recently, novel molecular biological methods based on the direct analysis of DNA (or RNA) have been used to identify bacteria in the environment. Such studies contribute to a better knowledge of the microbial community of complex ecosystems such as dairy products, and therefore to a better understanding of the behaviour of some micro-organisms. The potential of one of these methods, temporal temperature gradient gel electrophoresis (TTGE), was evaluated by analysing the bacterial composition of several raw milks. Total bacterial DNA is extracted from raw milks, and a discriminating zone of the 16S rDNA (V3 region) is amplified by PCR. The resulting DNA fragments are separated using denaturing electrophoresis. The bacterial community is represented by an electrophoresis profile where each band corresponds to a defined species or to a group of species. Bacteria in the unknown ecosystem are assigned an identity by comparison with a bacterial reference database (83 species) previously determined using DNA fragments amplified from pure bacterial strains. Ten raw milks (five un-cooled samples from the morning milking and five cooled samples of pooled milks) were analysed by TTGE. Species with a low % GC V3 sequence (<55%) are reported in this study. TTGE is proven to be a powerful and simple method to rapidly identify (by assignment using the reference database) a broad range of bacterial species within raw milk samples. A combined TTGE and specific PCR approach is found to be necessary for an accurate and full species identification.

Résumé
Les nouvelles techniques de biologie moléculaire basées sur l'analyse directe de l'ADN (ou ARN) dans son milieu contribuent à l'heure actuelle à une meilleure connaissance de la communauté microbienne des écosystèmes complexes comme les produits laitiers, et ainsi à mieux appréhender le comportement de certains micro-organismes. Le potentiel d'une de ces techniques, la TTGE ou temporal temperature gradient gel electrophoresis, a été évalué pour l'étude bactérienne de quelques laits crus. Après extraction de l'ADN bactérien total des laits crus, une région discriminante de l'ADNr 16S (la région variable V3) est amplifiée par PCR. Les fragments d'ADN obtenus sont ensuite séparés par électrophorèse en conditions dénaturantes. La communauté bactérienne est ainsi représentée par un profil électrophorétique où chaque bande peut correspondre à une espèce ou à un groupe d'espèces taxonomiquement proches ou non. L'identification se fait à l'aide d'une base de données de référence préalablement établie à partir de fragments d'ADNr 16S (région V3) de souches pures de bactéries. Dix laits crus (5 laits non refroidis de la traite du matin et 5 laits refroidis de mélange) ont été analysés par TTGE. Seule la flore bactérienne dont la teneur en bases GC de la séquence V3 est inférieure à 55 % a été effectivement décrite dans cette étude. L'identification par référence des bandes à une base de données suffisamment représentative de la flore bactérienne bas GC des laits crus nous a permis d'obtenir en 3 jours une vision globale de la communauté bactérienne majoritaire de ces laits. L'approche combinée de la TTGE avec une PCR spécifique s'est avérée cependant indispensable pour une identification précise et complète des espèces bactériennes.

Key words: Raw milk / temporal temperature gradient gel electrophoresis / 16S rDNA / microbial ecology

Mots clés : Lait cru / électrophorèse TTGE / ADNr 16S / écologie microbienne

Correspondence and reprints: Véronique Lafarge v.lafarge@afssa.fr

© INRA, EDP Sciences 2004