Lait 75 (1995) 193-210
DOI: 10.1051/lait:1995314

Analysis of major bovine milk proteins by on-line high-performance liquid chromatography and electrospray ionization-mass spectrometry

J. Léonil^a, D. Mollé^a, F. Gaucheron^a, P. Arpino^b, P. Guénot^c and J.L. Maubois<sup>a

a</sup>  Laboratoire de Recherches de Technologie Laitière, INRA, 65, rue de St-Brieuc, 35042 Rennes Cedex
^b  Laboratoire de Chimie Analytique, Institut National Agronomique, 16, rue Claude-Bernard, 75231 Paris Cedex 05
^c  Centre Régional de Mesures Physiques de l'Ouest, Université de Rennes I, Campus de Beaulieu, 35042 Rennes Cedex. France

(Received 24 January 1995; accepted 2 March 1995)

Abstract - Proteins from skim milk, paracaseinate and whey have been successfully analyzed by reverse-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) coupled with electrospray ioniza-tion mass spectrometry (ESI-MS). The major milk proteins were identified by comparison of molecular masses determined by ESI-MS to molecular masses calculated from amino acid composition deduced from primary structures and cDNA sequences for some proteins. This method has permitted the simultaneous identification of caseins and whey protein variants. Observed molecular masses of major milk proteins were found to be 19 038.0 ± 2.2 Da for K-CN A-1P (number of experiments n = 6); 19 007.0 ±1.1 Da for K-CN B-1P (n = 4); 25 230.0 ±2.1 Da for α_S2-CN A (n = 9); 23 617.2 ± 1.3 Da for α_s1-CN B-8P (n = 14); 24 092.0 ± 1.7 Da for β-CN B-5P (n = 6); 24 025.3 ± 1.0 Da for β-CN A¹-5P (n = 14); 23 984.8 ± 0.7 Da for β-CN A²-5P (n = 14); 18 278.3 ± 2.2 Da for the monomeric form of β-LG B (n = 5); 18 364.8 ± 1.6 Da for the monomeric form of β-LG A (n = 5); 14 179.21 ± 3.14 Da for α-LA (n = 5). Hence an accuracy of 0.01 % was obtained by ESI-MS analysis. It was also shown that the on-line coupling of HPLC with ESI-MS offers a very promising alternative for studying the proteolysis and determining the specificity of used enzymes in some technological treatments as shown for milk-clotting enzymes.

Résumé - Analyses des protéines bovines laitières majeures par chromatographie liquide haute performance en phase inverse couplée à la spectrométrie de masse à source d'ionisation electrospray
Les protéines d'un lait écrémé, d'un paracaséinate et du lactosérum correspondant ont été analysées par chromatographie liquide haute performance en phase inverse (RP-HPLC) couplée à un spectromètre de masse équipé d'une source à ionisation en mode electrospray (ESI-MS). Les principales protéines laitières ont été identifiées par comparaison des masses moléculaires déterminées par spectrométrie de masse avec les masses moléculaires calculées à partir de la composition en acides aminés de chaque protéine, et des séquences déduites de l'ADNc quand elles existent. Cette méthode permet l'identification simultanée des principaux variants génétiques des caséines et des protéines solubles. Les masses moléculaires des principales protéines laitières déterminées avec une précision de 0,01% sont les suivantes : 19 038,0 ± 2,2 Da pour κ-CN A-1P (nombre d'essais, n = 6); 19 007,0+ 1,1 Da pour κ-CN B-1P (n =4) ; 25 230,0 + 2,1 Da pour α_s2-CN A (n = 9); 23 617,2 ± 1,3 Da pour α_s1-CN B-8P (n = 14); 24 092,0 ± 1,7 Da pour β-CN B-5P (n = 6); 24 025,3 ± 1,0 Da pour β-CN A-1 5P (n= 14), 23 984,8 ± 0,7 Da pour β-CN A2-5P (n = 14); 18 278,3 ± 2,2 Da pour la forme monomérique de la β-LG B (n = 5) ; 18364,8 ± 1,6 Da pour la forme monomérique de la β-LG A (n =5); 14 179,2 3,14 Da pour α-LA (n = 5). Par ailleurs, le couplage entre la chromatographie liquide haute performance et la spectrométrie de masse à source d'ionisation electrospray constitue un excellent moyen pour étudier la protéolyse se produisant au cours de certains traitements technologiques. Cela est illustré par l'étude de la coagulation du lait par la chymosine et la protéase d'Endothia parasitica.

Key words: mass spectrometry / electrospray / milk protein / genetic variant / milk-clotting enzyme / paracaseinate / molecular mass / on-line HPLC / ESI-MS

Mots clés : spectrométrie de masse / electrospray / protéine laitière / variant génétique / enzyme coagulante / paracaséinate / coagulation / couplage HPLC / ESI-MS