Extracellular proteinases from Micrococcus GF : II. Isolation and characterization

Abstract - Micrococcus sp GF, a microorganism isolated from a farmhouse blue cheese, produced 2 extracellular proteinases, / and II, which were purified 4 000 times to homogeneity with a yield of 10% by ultrafiltration, dialysis, freeze-drying and chromatography on DEAE-cellulose and Sephadex G-150. The optimum temperature for activity was around 45 °C for both enzymes. Proteinase / exhibited a pH optimum at 8.5 while proteinase II had a very broad optimum at pH 9.0 to 11.0. Both proteinases were activated by low concentrations of NaCl. They were considered to be metalloproteinases since they were inhibited by EDTA. Proteinase / was irreversibly inactivated by EDTA while the activity of apo-proteinase II was restored by treatment with Ca²⁺, Ba²⁺, Mg²⁺, Sr²⁺ or Zn²⁺. Both proteinases were inhibited by several heavy metals. Proteinase II was stimulated by some ions, especially Mg²⁺, while proteinase / was not. Molecular weights were estimated by SDS-PAGE to be around 23.5 and 42.5 kDa for proteinases / and II, respectively. Proteinase / hydrolyzed β-casein preferentially to α_s-casein, while proteinase II hydrolyzed both caseins at approximately the same rate.

Résumé - Protéinase extracellulaire de Micrococcus GF: II. Isolement et caractérisation
Micrococcus sp GF, un microorganisme isolé à partir d'un fromage bleu fermier, produit deux protéinases extracellulaires, protéinases / et II. Elles ont été purifiées 4000 fois, avec un rendement de 10%, jusqu'à homogénéité, par ultrafiltration, dialyse, lyophilisation et chromatographie sur DEAE-cellulose et Sephadex G-150.
La température optimale d'activité pour les deux enzymes est d'environ 45 °C. Le pH optimum d'activité de l'enzyme / est de 8,5 tandis que celui de l'enzyme II s'étend de 9 à 11. Les 2 protéinases sont activées par de faibles concentrations en NaCl. Elles sont considérées comme des métalloprotéinases car elles sont inhibées par l'EDTA. L'EDTA a inactivé irréversiblement la protéinase / tandis que l'activité de l'apo-protéinase II a été restaurée par des traitements au Ca²⁺, Ba²⁺, Mg²⁺, Sr²⁺ ou Zn²⁺. Plusieurs métaux lourds inhibent les deux protéinases. Certains ions, Mg²⁺ en particulier, stimulent l'activité de la protéinase II mais pas celle de la protéinase I.
Les poids moléculaires, estimés pour les 2 protéinases / et II par électrophorèse SDS-PAGE, étaient respectivement, voisins de 23,5 et de 42,5 kDa. La protéinase / hydrolyse préférentiellement la caséine β à la caséine α_s; tandis que la protéinase II hydrolyse les 2 caséines avec approximativement la même intensité.