Lait 71 (1991) 385-394
DOI: 10.1051/lait:1991330

Traitements de dénaturation appliqués à la β-lactoglobuline avant hydrolyse trypsique

C. Lung^{a, b}, D. Paquet^a and G. Linden<sup>a

a</sup>  Laboratoire de biochimie appliquée, associé à l'INRA, Université de Nancy I, Faculté des Sciences, BP239, 54506 Vandoeuvre-lès-Nancy cedex, France
^b  Adresse actuelle : La Prospérité Fermière, 51-53, avenue Fernand Lobbedez, BP 946, 62000 Arras Cedex, France

(Reçu le 10 août 1989; accepté le 11 février 1991)

Abstract - The effects of denaturation treatments on tryptic hydrolysis of β-lactoglobulin
The extraction of β-lactoglobulin from acid whey was achieved by ion exchange chromatography in batch (DEAE-Sephacel) followed by gel filtration chromatography (Sephadex G-100). The protein was denatured either by thermal treatment at 90 °C in diluted acid media or by cleavage of disulfide bonds. Solubility at the isoelectric pH of 99.5% was obtained for the native β-lactoglobulin, of 38% for the thermal treated substrate and of 5% for the reduced β-lactoglobulin. These different substrates were incubated with trypsin at 37 °C, pH 7.5 with various E / S ratios. Progress of hydrolysis was determined by measuring the number of peptide bonds cleaved by the TNBS method and by electrophoresis on SDS-polyacrylamide gel. With native β-lactoglobulin, the degree of hydrolysis exceeding 10% at 24 h could be obtained only at high E / S ratio (1 / 50 and 1 / 25): low molecular weight peptides were produced and could not be revealed by electrophoresis.
Partial denaturation by thermal treatment at 90 °C in media of low acid concentration (0.02 M HCl) induced an alteration: a set of polypeptides were identified by electrophoresis. This product seemed to be susceptible to tryptic hydrolysis. The reduction of disulfide bonds resulted in the appearance by tryptic hydrolysis of intermediate peptides detected by electrophoresis which were then gradually transformed into other final products. These results show the influence of pretreatment on the proteolysis of β-lactoglobulin and indicate the interest of combined enzymatic, thermal and chemical treatments.

Résumé - La β-lactoglobuline est isolée en 2 étapes à partir de lactosérum acide par chromatographie d'échange d'ions en "batch" (DEAE-Sephacel) suivie de chromatographie de filtration sur gel (Sephadex G-100).
On réalise soit un traitement thermique à 90 °C en milieu acide dilué, soit une coupure des ponts disulfures en milieu dénaturant. La solubilité au pHi est de 99,5% pour la β-lactoglobuline native, 38% pour le substrat chauffé en milieu acide et 5% pour la β-lactoglobuline réduite. Ces différents substrats sont alors soumis à un traitement enzymatique par la trypsine à 37 °C et pH 7,5. Les produits obtenus sont caractérisés par la mesure des liaisons peptidiques rompues (méthode au TNBS) et analyse électrophorétique en milieu dissociant (évaluation du poids moléculaire). L'hydrolyse trypsique du substrat dans l'état natif conduit à l'apparition de peptides de petites tailles. Le chauffage en milieu acide dilué modifie le substrat de départ et de nombreux polypeptides apparaissent; la trypsine hydrolyse très rapidement ces produits. La coupure des ponts disulfures induit une hydrolyse de la β-lactoglobuline par la trypsine en peptides de taille importante qui sont à leur tour hydrolysés.
Ces observations viennent souligner l'importance des pré-traitements appliqués à un substrat et l'intérêt que peut présenter la combinaison de traitements enzymatiques, thermiques et chimiques.

Key words: β-lactoglobulin / thermal treatment / disulfide bond reduction / tryptic hydrolysis

Mots clés : β-lactoglobuline / traitement thermique en milieu acide / réduction des ponts disulfures / hydrolyse trypsique