Lait 62 (1982) 671-680
DOI: 10.1051/lait:1982621-62244

Influence de la nature et du taux d'inactivation sur le dosage de la chymosine et de la pepsine bovine par électro immimo-diffusion

Pascaline GARNOT and D. MOLLE

Institut National de la Recherche Agronomique, Laboratoire de Recherches de Technologie Laitière, 65, rue de Saint-Brieuc - 35042 Rennes cedex (France)

Abstract - Influence of type and degree of inactivation on chymosin and bovine pepsin quantification by rocket immunoelectrophoresis
1. Last years, immunological methods have been proposed to titrate active enzyme in clotting extracts used for cheese-making, or in curd or cheese. However the consequences of loss of activity on results thus obtained were unknown.
2. Four types of inactivation were used : shaking, urea, temperature, pH. The experimental parameters were chosen in order to get samples having a range of residual activities between 0 and 100 % of the reference solution. For chymosin it was : a) shaking in a rotating tube (30 rpm) for 5,15 and 30 min at pH 5.5 at 20° C;
b) urea 6 M, pH 5.5 at 35° C for 10 and 30 min and 1,2 and 3 h;
c) 3, 7, 24 and 48 h at 50° C and 7 h at 55° C, at pH 5.5; d) 2, 4, 6, 8, 15 and 24 h at pH 7.0 at 35°C. For bovine pepsin: a) shaking in a rotating tube at pH 5.5 at 20° C for 6, 16, 24 h; b) urea 7.2 M, pH 5.5, at 35° C for 2, 5, 16 and 24 h; c) 6, 24 and 48 h at 50° C and 6, 24 h at 55° C; d) 6 and 24 h at pH 7.0 and 6, 24 and 48 h at pH 6.5 at 35° C.
The capacity for combining antibodies was estimated by rocket immunoelectrophoresis. Enzyme activity was measured by deter-mining the flocculation time of a ^K casein solution.
3. Results show net differences according to the enzyme and the type of inactivation : shaking does not change or only slightly the extent of antigene-antibody combination. Contrariwise, temperature changes active site and combining sites in the same extent or almost the same for pepsin. Effect of pH and urea is also identical or almost on both types of sites for chymosin. For pepsin, immunological reaction is not or very slightly affected even after a complete inactivation.
4. Structural modifications producing inactivation of the enzyme do not have necessarily the same effect on the capacity for combining with antibodies. Chymosin has a more sensitive structure from an enzymatic point of view as well as from an immunological one. Therefore it is necessary to be very careful when using an immunological method to titrate active enzyme. Risks of over-estimate are important, especially with pepsin, in case of inactivation even if partial

Résumé - 1. Au cours de ces dernières années des méthodes immunologiques ont été proposées pour doser l'enzyme actif dans les extraits coagulants utilisés en fromagerie et dans le caillé ou le fromage. Cependant, les conséquences d'une perte d'activité sur les résultats obtenus par ces méthodes étaient mal précisées.
2. Quatre types d'inactivation (pH, urée, agitation, température) ont été utilisées. L'aptitude à se conjuguer aux anticorps était évaluée par électro immuno-diffusion. L'activité enzymatique était mesurée par détermination du temps de floculation d'une solution de caséine K. Les deux enzymes constitutifs de la présure de veau, chymosine et pepsine, ont été étudiés.
3. Les résultats montrent des différences très nettes selon la nature de l'enzyme et le type d'inactivation subie : l'agitation modifie pas ou peu la réaction antigène-anticorps. A l'opposé la température altère dans des proportions identiques, ou presque pour la pepsine, le site actif et les déterminants antigéniques. L'effet de l'urée et du pH est également identique ou presque sur les deux sites dans le cas de la chymosine. Dans le cas de la pepsine la réaction immunologique n'est pas ou très peu affectée même après une inactivation quasi-totale.
4. Les modifications de structure entraînant une inactivation de l'enzyme n'ont pas forcément un effet identique sur l'aptitude à se conjuger aux anticorps. La chymosine a une structure nettement plus sensible aux agents testés que ce soit d'un point de vue enzymatique ou immunologique. Il importe donc d'être très prudent dans l'utilisation d'une méthode immunologique pour doser une quantité d'enzyme actif. Les risques de surestimation sont importants, surtout avec la pepsine, s'il y a une inactivation même partielle

Key words: Immunology / Rocket immunoelectrophoresis / Inactivation / pH / Urea / Temperature / Shaking / Chymosin / Bovine pepsin

Mots clés : Immunologie / Electro immuno-diffusion / Inactivation / pH / Urée / Temperature / Agitation / Chymosine / Pepsine bovine