Lait 87 (2007) 251-268
DOI: 10.1051/lait:2007027

Methods to determine denaturation and aggregation of proteins in low-, medium- and high-heat skim milk powders

Hasmukh A. Patel^{a, b, c}, Skelte G. Anema^{a, b}, Steve E. Holroyd^a, Harjinder Singh^b and Lawrence K. Creamer<sup>b

a</sup>  Fonterra Research Centre, Private Bag 11029, Palmerston North, New Zealand
^b  Riddet Centre, Massey University, Private Bag 11222, Palmerston North, New Zealand
^c  Institute of Food, Nutrition and Human Health, Massey University, Private Bag 11222, Palmerston North, New Zealand

(Published online: 26 October 2007)

Abstract - Skim milk powders (SMPs) of different heat classifications are used in recombined milks and milk products. These SMPs are broadly classified as low-, medium- and high-heat powders, based on their whey protein nitrogen index (WPNI). The WPNI is a measure of undenatured whey protein nitrogen (WPN) content (expressed as milligrams of WPN per gram of powder). This heat classification, based on the WPNI, gives an indirect indication of the denaturation and aggregation of whey proteins and thus the severity of the heat treatments that were used during the manufacture of milk powders. The severity of heat treatment has an impact on the functional properties of the resultant powders or their suitability for different applications. In the present study, we measured the WPNIs of a range of SMPs using a dye binding method (reference method) and attempted to correlate these results with the WPNI predicted using Fourier transform near infra-red (FT-NIR) spectra, and with denaturation and aggregation of proteins as analysed using various polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and capillary electrophoresis (CE) methods. In most cases, FT-NIR spectroscopy provided a rapid method for predicting the WPNI of milk powders, with good correlation ( ). The correlation was used to successfully predict the WPNI of a new set of powders, and the method could potentially be used to determine the WPNI routinely using appropriate controls. The denaturation and aggregation of native monomeric whey proteins as analysed by PAGE and CE correlated well with the WPNI of the respective SMP samples. Modified one-dimensional sodium dodecyl sulfate (SDS)-PAGE and two-dimensional SDS- and then reduced SDS-PAGE gave an indication of the type and composition of disulfide-linked protein aggregates and showed some interesting differences between possible protein-protein interactions involved in the manufacture of low-, medium- and high-heat SMPs. The low-heat powder (WPNI 6.76 mg WPNg^-1 powder) retained most of the whey proteins in the native state. In contrast, the high-heat powder (WPNI 0.33 mg WPNg^-1 powder) contained a comparatively small proportion of native whey proteins, although some -lactalbumin was present. The degree of denaturation of -lactoglobulin appeared to be crucial and could be related to the WPNI.

Résumé - Méthodes de détermination de la dénaturation et de l'agrégation des protéines dans des poudres de lait écrémé "low-heat", "medium-heat" et "high-heat"
Des poudres de lait écrémé de différentes classifications thermiques sont utilisées dans les laits et produits laitiers recombinés. Ces poudres sont en général classées en "low-heat", "medium-heat" et "high-heat" selon leur indice d'azote des protéines solubles (WPNI). Cet indice mesure la teneur en azote des protéines de lactosérum (WPN) non dénaturées exprimée en mgg^-1 de poudre. Cette classification thermique, basée sur le WPNI, donne une indication indirecte sur la dénaturation et l'agrégation des protéines de lactosérum et ainsi sur la sévérité des traitements thermiques utilisés au cours de la fabrication des poudres de lait, sévérité dont dépendent les propriétés fonctionnelles des poudres et leur aptitude à différentes applications. Dans la présente étude, nous avons mesuré les valeurs de WPNI d'une gamme de poudres à l'aide d'une méthode colorimétrique (méthode de référence) et tenté de corréler ces résultats avec le WPNI prédit à l'aide de la spectroscopie FT-NIR, et avec la dénaturation et l'agrégation des protéines analysées à l'aide de plusieurs méthodes d'électrophorèse PAGE et capillaire (CE). Dans la plupart des cas, la spectroscopie FT-NIR s'avère être une méthode rapide de prédiction du WPNI des poudres de lait, avec une bonne corrélation ( ). La corrélation a été utilisée avec succès pour prédire le WPNI d'un nouveau lot de poudres ; la méthode peut être utilisée pour déterminer le WPNI en routine sous réserve des contrôles appropriés. La dénaturation et l'agrégation des protéines de lactosérum natives monomères analysées par PAGE et CE étaient bien corrélées au WPNI des échantillons respectifs de poudre de lait écrémé. Une méthode modifiée SDS-PAGE 1D, SDS-PAGE 2D puis SDS-PAGE 2D en présence d'un agent réducteur donnait une indication du type et de la composition des agrégats de protéines liées par des ponts disulfure et montrait quelques différences intéressantes entre les interactions protéines/protéines possibles impliquées dans la fabrication des poudres "low-heat", "medium-heat" et "high-heat". La poudre "low-heat" (WPNI 6,76 mg WPNg^-1 de poudre) retenait la majorité des protéines de lactosérum à l'état natif. A l'opposé, la poudre "high-heat" (WPNI 0,33 mg WPNg^-1 de poudre) contenait comparativement peu de protéines de lactosérum natives, mais avec quand même la présence d'un peu d'-lactalbumine. Le degré de dénaturation de la -lactoglobuline s'avère être crucial et peut être relié au WPNI.

Key words: skim milk powders / WPNI / protein denaturation and aggregation / 1D and 2D gel electrophoresis / FT-NIR

Mots clés : poudre de lait écrémé / WPNI / protéine de lactosérum / dénaturation / agrégation / électrophorèse / spectroscopie FT-NIR

Corresponding author: Hasmukh.Patel@fonterra.com

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