DOI: 10.1051/lait:2001104

Lait 81 (2001) 775-785

Highly sensitive periodic acid/Schiff detection of bovine milk glycoproteins electrotransferred after nondenaturing electrophoresis, urea electrophoresis, and isoelectric focusing

Antonio Silvio Egito, Jean-Michel Girardet, Laurent Miclo and Jean-Luc Gaillard

Laboratoire des BioSciences de l'Aliment, unité associée à l'INRA n° 885, Faculté des Sciences, Université Henri Poincaré, Nancy 1, BP 239, 54506 Vandoeuvre-lès-Nancy Cedex, France

(Received 17 February 2001; accepted 9 April 2001)

Abstract
Due to its lack of sensitivity, periodic acid/Schiff (PAS) staining of gels is not considered to be relevant for the detection of glycoproteins other than mucin-type glycoproteins after nondenaturing or urea polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). A simple and highly sensitive method was developed for the detection of bovine milk glycoproteins separated by nondenaturing PAGE, urea-PAGE, and isoelectric focusing. After electrophoresis, proteins were electrotransferred onto a polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane and then glycoproteins were specifically stained by the Schiff's reagent after periodic acid oxidation. This method allowed the detection of the glycosylated forms of bovine -lactalbumin with sufficient sensitivity after nondenaturing PAGE or isoelectric focusing of whey proteins. Combination of isoelectric focusing and PAS detection on a PVDF membrane provided a resolutive tool in the characterization of the different glycoforms of -casein and also of component PP3 of proteose peptones. Distinction between the non-glycosylated and glycoforms of -casein separated by urea-PAGE or isoelectric focusing was performed by comparing Coomassie blue staining and PAS staining. Moreover, amino-terminal microsequencing of glycoproteins immobilized on the membrane could be performed after PAS staining.

Résumé
Révélation très sensible des glycoprotéines du lait bovin par le réactif de Schiff après électrotransfert des protéines séparées par électrophorèse non dénaturante, électrophorèse en présence d'urée et isoélectrofocalisation. À cause de sa faible sensibilité, la révélation acide périodique / Schiff (PAS) n'est pas applicable pour la détection des glycoprotéines autres que les mucines après électrophorèse en gel de polyacrylamide (PAGE) en conditions non dénaturantes ou en présence d'urée. Une méthode simple et très sensible a été développée pour la détection des glycoprotéines du lait bovin après leur séparation par PAGE non dénaturante, PAGE-urée et focalisation isoélectrique. Après électrophorèse, les protéines sont électrotransférées sur une membrane de polyvinylidène difluoride (PVDF) et les glycoprotéines sont ensuite révélées spécifiquement par le réactif de Schiff après oxydation à l'acide périodique. Ainsi, les formes glycosylées de l'-lactalbumine ont été détectées avec une bonne sensibilité après PAGE non dénaturante ou focalisation iso-électrique des protéines du lactosérum. L'association de la focalisation isoélectrique et de la révélation PAS sur membrane de PVDF offre une séparation résolutive des glycoformes de la caséine ainsi que des glycoformes du composant PP3 des protéoses-peptones. La distinction entre les formes non glycosylées et glycosylées de la caséine séparées par PAGE-urée ou focalisation isoélectrique a été réalisée en comparant la révélation PAS à la révélation au bleu de Coomassie. Le microséquençage amino-terminal de glycoprotéines immobilisées sur membrane a pu être réalisé après révélation PAS.

Key words: bovine milk protein / glycoprotein / electrophoresis / isoelectric focusing / electroblotting / Schiff's reagent

Mots clés : protéine du lait / glycoprotéine / électrophorèse / focalisation isoélectrique / électrotransfert / réactif de Schiff

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