Characterization of an L-serine dehydratase activity in permeabilized cells of Brevibacterium linens ATCC 9175

Abstract - Brevibacterium linens ATCC 9175 produces large quantities of ammonia and pyruvate from L-serine. This reaction occurs via an L-serine dehydratase (EC.4.2.1.13), whose activity is maximal at the end of exponential growth on rich medium and which abruptly decreases at the beginning of the stationary phase. It is not possible to extract the soluble form of the enzyme without a total loss of activity. Subcellular localization studies after creating stable protoplasts with lysozyme have shown that a part of the activity is bound to cell membranes. A stable form of activity has been obtained by treating the cells with Triton X-100 and the main properties of the enzyme have been studied with this insoluble form. The apparent Michaelis constant is 50 mM and the Vmax is 200 nmol of pyruvate formed per minute and per mg of dry extract. The optimum pH is included between 8.5 and 9.4 and activity is very stable between 8.0 and 9.4. The enzyme is slightly thermostable. The exclusive substrate is L-serine. D-serine and 2-aminoethanol are competitive inhibitors. L-serine dehydratase activity is strongly inhibited by o-phenanthroline. Pyridoxal phosphate is required for maximum activity.

Résumé - Caractérisation d'une activité L-serine deshybratase dans les cellules permeabilisées de Brevibacterium linens ATCC 9175
Brevibacterium linens ATCC 9175 produit de grandes quantités d'ammoniac et de pyruvate à partir de la L- sérine. Cette réaction est due à une enzyme de type L- sérine déshydratase (E.C. 4.2.1.13) dont l'activité est maximum en fin de croissance exponentielle dans un milieu complexe. Elle décroît ensuite rapidement dès le début de la phase stationnaire de croissance. Il n'a pas été possible d'extraire l'enzyme sous une forme soluble sans avoir une perte totale de son activité. Des essais de localisation cellulaire de l'activité ont été tentés après obtention par action du lysozyme de protoplastes stables. Il est montré qu'une partie de l'activité est liée à la fraction membranaire de la cellule. Par contre, une forme stable de l'activité enzymatique était obtenue par traitement des cellules au Triton X 100. Les principales propriétés de cette enzyme ont donc pu être étudiées sous cette forme insoluble.
La constante apparente de Michaelis est de 50 mM et la vitesse maximum apparente de 200 nmoles de pyruvate formé par minute et par mg d'extrait sec cellulaire. Le pH optimum est compris entre 8,5 et 9,4. L'activité est très stable entre 8,0 et 9,4. La température optimale d'action est comprise entre 26 et 35° C. Les cinétiques d'inactivation thermique montrent que l'enzyme est stable jusqu'à 30° C mais qu'elle s'inactive rapidement à 40° C. L'enzyme est très spécifique puisque seule la L- sérine est substrat. La D- sérine et le 2- amino-éthanol sont des inhibiteurs compétitifs. D'autre part, cette activité L- sérine déshydratase est fortement inhibée par l'ortho- phénanthroline. L'E.D.T.A. entraîne au contraire un effet stimulant de l'activité aux concentrations inférieures à 10^-3 M, puis devient inhibiteur aux concentrations supérieures. Le pyridoxal phosphate est exigé pour obtenir une activité maximum