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Issue
Lait
Volume 82, Number 6, November-December 2002
Page(s) 657 - 671
DOI https://doi.org/10.1051/lait:2002040
Lait 82 (2002) 657-671
DOI: 10.1051/lait:2002040

Purification and characterization of the X-prolyl-dipeptidyl aminopeptidase (PepX) from Streptococcus macedonicus and cloning of the pepX gene

Marina D. Georgalaki, Marina Papdelli, Rania Anastasiou, George Kalantzopoulos and Effie Tsakalidou

Laboratory of Dairy Research, Department of Food Science and Technology, Agricultural University of Athens, Iera Odos 75, 118 55 Athens, Greece
(Received 30 October 2001; accepted 6 February 2002)

Abstract
The X-prolyl-dipeptidyl aminopeptidase from Streptococcus macedonicus ACA-DC 191 was purified by anion exchange and hydrophobic interaction chromatography. A single band of a molecular mass of about 84 000 g $\cdot$mol -1 appeared in SDS-PAGE; by gel filtration it was shown that the native enzyme was dimeric. The enzyme showed optimum activity on glycyl-prolyl-4-nitroanilide at pH 7.0, with a $K_{\rm M}$ = 0.42 mmol $\cdot$L -1 and a V $_{{\rm max}}$ = 12.8 $\mu$mol $\cdot$mg $^{-1}\cdot$min -1. It was active over a temperature range of 10-60 °C. Over 60 °C, the enzyme activity declined rapidly. The peptidase was completely inactivated by PMSF, DTNB and Cu 2+, while metal chelators had no effect on enzyme activity. By using the PCR technique with synthetic primers, the pepX gene was amplified, cloned and sequenced. This 2 289 nucleotide gene encodes a protein of 763 amino acids with a molecular mass of 86 866 g $\cdot$mol -1. The deduced amino acid sequence analysis of the pepX gene shows a high identity with PepX enzymes from other lactic acid bacteria and contains a motif around the active site serine (G-K-S-Y-L-G) that is well conserved among the PepX enzymes.

Résumé
Purification et caractérisation de la X-prolyl-dipeptidyl aminopeptidase (PepX) de Streptococcus macedonicus et clonage du gène pepX. Une X-prolyl-dipeptidyl aminopeptidase extraite de Streptococcus macedonicus ACA-DC 191 a été purifiée par chromatographie échangeuse d'anions et chromatographie d'intéractions hydrophobes. Une seule bande de masse moléculaire de 84 000 g $\cdot$mol -1 a été detectée sur SDS-PAGE ; par chromatographie d'exclusion de taille il a été démontré que l'enzyme native était dimérique. L'enzyme a une activité maximale sur le substrat glycyl-prolyl-4-nitroanilide à pH 7,0, avec $K_{\rm M}$ = 0,42 mmol $\cdot$L -1 et V $_{{\rm max}}$ = 12,8 $\mu$mol $\cdot$mg $^{-1}\cdot$min -1. Elle est active dans une gamme de températures de 10-60 °C. Au-dessus de 60 °C, l'activité enzymatique diminue rapidement. La peptidase est complètement inactivée par le PMSF, le DTNB et les ions Cu 2+, mais des chélateurs de métaux n'ont aucun effet sur l'activité enzymatique. En utilisant la technique de PCR avec des primers synthétiques, le gène pepX a été amplifié, cloné et séquencé. Ce gène, de 2 289 nucléotides code pour une protéine de 86 866 g $\cdot$mol -1. La séquence en acides aminés déduite du gène pepX présente une forte identité avec les enzymes PepX des autres bactéries lactiques. La séquence entourant la sérine du site actif (G-K-S-Y-L-G) est assez bien conservée chez les enzymes PepX.


Key words: Streptococcus macedonicus / X-prolyl-dipeptidyl aminopeptidase / PepX purification / enzyme characterization / cloning

Mots clés : Streptococcus macedonicus / X-prolyl-dipeptidyl aminopeptidase / purification de PepX / caractérisation / clonage

Correspondence and reprints: Effie Tsakalidou Tel.: (+30) 10 529 4676; fax: (+30) 10 529 4672;
    e-mail: et@aua.gr

© INRA, EDP Sciences 2002

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