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Issue
Lait
Volume 77, Number 6, 1997
Page(s) 683 - 697
DOI https://doi.org/10.1051/lait:1997649
Lait 77 (1997) 683-697
DOI: 10.1051/lait:1997649

Combined high resolution chromatographic techniques (FPLC and HPLC) and mass spectrometry-based identification of peptides and proteins in Grana Padano cheese

P. Ferrantia, E. Itollia, F. Baronea, A. Malornib, G. Garroa, P. Laezzaa, L. Chianesea, F. Migliaccioa, V. Stingoa and F. Addeoc

a  Dipartimento di Scienza degli Alimenti dell'Università degli Studi di Napali Federico II, 1-80055 Portici
b  Servizio di Spettrometria di Massa, CNR. Via Pansini 5, I-80131 Napoli
c  Istituto Sperimentale Lattiero-Caseario, Via A Lombardo 11, 1-20075 Lodi, Italy

Abstract - The 0.2 mol / L trisodium citrate soluble N fraction of 14- and 38-month-old Grana Padano (GP) cheese diafiltered through 3- and 10-kDa cut-off membranes gave two fractions containing peptides with a molecular mass lower than 3 kDa, and higher than 10 kDa. 91 and 38 oligopeptides lower than 3 kDa were identified by using a combination of fast-atom bombardment / mass spectrometry and Edman degradation in the 14- and 38-month-old GP cheese samples respectively. Peptides higher than 10 kDa were submitted to preparative fractionation on Mono Q column with a stepwise ionic strength gradient and then by reverse phase-HPLC on a C4 column. Some native caseins and large-derived peptides were identified by using a combination of electrospray mass spectrometry and Edman degradation.


Résumé - Identification de peptides et protéines dans le fromage Grana Padano à l'aide de techniques chromatographiques haute résolution (FPLC et HPLC) couplées à la spectrométrie de masse
La matière azotée soluble dans le tampon citrate 0,2 mol / L à pH 8,0 de deux échantillons de 14 et 38 mois de Grana Padano, un fromage italien à pâte dure, a été diafiltrée sur membranes à porosité de 3 et 10 kDa. Deux fractions ont été recueillies, contenant des peptides de masse moléculaire inférieure à 3 kDa et supérieure à 10 kDa. La fraction inférieure à 3 kDa a été fractionnée par chromatographie liquide haute performance (CLHP) en phase inverse sur colonne C18 et les peptides identifiés en combinant la spectrométrie de masse à bombardement rapide et la dégradation d'Edman. La plupart des 91 peptides identifiés dans cette fraction A du fromage de 14 mois provenaient des caséines αsl (44 peptides) et β (32 peptides). La majorité de ces derniers présentaient une origine commune dans la région 1-105 / 107 de la caséine β. Trente peptides résultaient de la dégradation du peptide αsl -CN (f1-79) formé par action de la plasmine sur la caséine αs1. Treize peptides provenaient de la caséine αs2 et un seul de la para-κ-caséine. Trente-huit peptides ont été identifiés dans la fraction inférieure à 3 kDa du fromage de 38 mois (dont 21 peptides identifiés dans le fromage jeune) : 8 issus de la caséine β, 27 de la caséine αs1, 1 de la caséine αs2, et 2 de la para-κ-CN. La fraction supérieure à 10 kDa a été soumise à un fractionnement sur colonne Mono Q, puis à une séparation par CLHP en phase inverse sur colonne C4. Les peptides ont été identifiés en combinant la spectrométrie de masse à l'électrospray et la dégradation d'Edman. Les résultats concernant une fraction chromatographique sont présentés : les variants B et C de la caséine αs1 et plusieurs fragments de grosse taille tels que le peptide αs1-CN-I ont été identifiés. Les résultats montrent que les différentes techniques de spectrométrie de masse permettent de caractériser, mieux que d'autres techniques, la nature des peptides issus des caséines, quelle que soit leur taille.


Key words: Grana Padano / casein proteolysis / oligopeptide / mass spectrometry

Mots clés : Grana Padano / protéolyse / peptide / spectrométrie de masse