Efficient system for genetic modification of lactic bacteria: construction of food grade strains

Abstract - The construction of recombinant strains of lactic bacteria has become an important objective for many researchers. New strains may resolve some of the pre-existing problems in industrial fermentation, and may offer new approaches to meeting medical and pharmaceutical needs. Such an approach is limited by technical problems of manipulation of the lactic bacteria. We have there-fore focused on the methodology for the isolation of recombinant strains. Here, we describe the development of a broad host range thermosensitive (Ts) vector, pG⁺host, which allows efficient integration of DNA by single and double crossing over into the chromosome of a variety of Gram-positive bacteria. pG+host has been adapted with an origin of transfer which allows it to be mobilized in trans by a conjugative helper plasmid derived from broad host range plasmid pIP501. We describe a method, using pG⁺host, which permits the construction of food grade recombinant strains, ie, the integration of foreign DNA (or other modifications) without leaving a selectable marker behind. Using this method, 1-40 % of a bacterial population underwent replacement recombination in the absence of selection for the replacing DNA. With selection, 50-98 % of chromosomal replacements were selected. Possible desirable features of recombinant lactic strains are discussed.

Résumé - Système efficace de remplacement de gènes chez les bactéries lactiques
L'amélioration des souches de bactéries lactiques par manipulation génétique est devenue un objectif essentiel pour de nombreux chercheurs. En effet, la construction de souches recombinantes pourrait résoudre certains problèmes liés aux fermentations industrielles et offrir aux bactéries lactiques de nouvelles applications dans les domaines médicaux et pharmaceutiques. Nous décrivons un plasmide thermosensible (pG⁺host) à large spectre d'hôtes qui facilite la construction de souches recombinantes pG+host permet l'intégration d'ADN par simple ou double crossing over (dco) dans le chromosome de diverses bactéries à Gram positif. Le procédé de dco introduit uniquement l'ADN étranger ou la modification chromosomique d'intérêt, le reste du matériel génétique de la cellule étant inchangé. Pour cette raison, les bactéries modifiées par ce procédé répondent aux normes en vigueur pour une utilisation agroalimentaire. Dans L lactis, nous avons obtenu 1 à 40% de bactéries modifiées par dco sans sélectionner le nouveau gène et 50 à 98% de dco en le sélectionnant. Un dérivé de pG+host mobilisable par le système de conjugaison de pIP501 a aussi été construit, il permet d'envisager le transfert du pG+host dans des bactéries non transformables, puis d'y appliquer nos méthodes de modifications chromosomiques.