Heterologous gene expression and secretion in Bifidobacterium longum

Abstract - Strains of the genus Bifidobacterium are used in fermented dairy products where they are supposed to exert health-promoting effects on the consumers. To study Bifidobacterium sp. properties, to improve the strains or to use them for safe delivery of vaccinal or anticarcinogenic polypeptides into the human digestive tract, it is strategically important to develop a system for heterologous expression and secretion. For this purpose, we constructed pBESAF2, a secretion vector based on the -amylase expression and secretion signals (ESS) isolated from Bifidobacterium adolescentis. The signal peptide was analyzed in silico and its cleavage site was experimentally determined by N-terminal sequencing of the mature amylase. To validate this secretion vector, the phytase structural gene from Escherichia coli MC4100 was cloned downstream of the ESS and the resulting plasmid was introduced into Bifidobacterium longum MG1. Recombinant cells expressed phytase (with activity up to 21.1 U) and more than 95% of the phytase activity was found in the culture medium, suggesting that E. coli phytase can be produced and properly secreted and folded when expressed in B. longum. This is the first report of the development of a secretion vector for bifidobacteria and its use in a heterologous protein export in B. longum. This work is the first step towards the production of other proteins of food or therapeutic interest in bifidobacteria.

Résumé - Expression hétérologue et sécrétion chez Bifidobacterium longum. Certaines souches du genre Bifidobacterium sont utilisées dans des produits laitiers fermentés pour leurs potentiels effets bénéfiques sur la santé de l'hôte. Pour étudier les propriétés de Bifidobacterium sp., pour améliorer les souches ou pour les utiliser afin de délivrer des protéines vaccinales ou anticancéreuses dans le tube digestif de l'homme, il est stratégiquement primordial de développer un système d'expression et sécrétion hétérologue pour Bifidobacterium sp. À cette fin, nous avons construit pBESAF2, un vecteur de sécrétion utilisant des signaux d'expression et de sécrétion (SES) d'une amylase isolée de Bifidobacterium adolescentis. Le peptide signal a été analysé in silico et son site de clivage a été déterminé par séquençage amino-terminal de l'amylase mature. Pour valider ce vecteur de sécrétion, le gène spécifiant la phytase d'Escherichia coli MC1400 a été cloné en aval des SES et le plasmide résultant a été introduit dans B. longum MG1. Les bactéries recombinantes exprimaient la phytase (avec une activité allant jusqu'à 21,1 U) et plus de 95 % de l'activité phytase était détectée dans le surnageant de culture. Ce travail décrit la mise au point du premier vecteur de sécrétion spécifiquement développé pour Bifidobacterium ainsi que son utilisation chez B. longum pour exprimer et sécréter une forme active de la phytase d'E. coli. Ce résultat ouvre la voie à la production d'autres protéines d'intérêt agro-alimentaire ou thérapeutique.