DOI: 10.1051/lait:2001132

Lait 81 (2001) 289-300

La biosynthèse d'exopolysaccharide par des souches de pediococcus damnosus isolées du vin : mise au point d'outils moléculaires de détection

Émilie Walling, Emmanuel Gindreau and Aline Lonvaud-Funel

Faculté d'OEnologie, Laboratoire de Biotechnologie et Microbiologie Appliquée, Unité associée INRA-Université Victor Ségalen Bordeaux 2, 351 cours de la Libération, 33405 Talence, France

Abstract
Exopolysaccharide biosynthesis by Pediococcus damnosus strains isolated from wine: elaboration of molecular detection tools . Lactic acid bacteria synthesize exopolysaccharides (EPS). These carbohydrate polymers excreted or produced at the cell membrane can drastically increase viscosity of the medium. In dairy industry, this property is used to improve the texture of yoghurts for example. Other microbial EPS are currently under study for their possible use in food processes or in medicine. However, cider, beer and wine are spoiled by the presence of EPS. In "ropy wines", particular strains of Pediococcus damnosus are responsible for the production of a -D-glucan. For P. damnosus strains isolated from ropy wines, glucan production is linked to a plasmid of approximately 5 500 bp. The ropy phenotype disappears when the plasmid is lost. This plasmid is currently being sequenced and several open reading frames (ORF) have already been revealed. The amino acid sequence of the first ORF has high identity scores with a plasmid mobilization protein of Lactobacillus casei. The second ORF contains several motifs characterized on a glucosyltransferase from Streptococcus pneumoniae type 37 which produces the same polysaccharide as the Pediococcus strains isolated from ropy wines. From the partial sequence of the plasmid, molecular tools for detection of spoiling strains in wine were obtained. They involve PCR, Southern blot and colony hybridization. A new probe called "GT probe" has been isolated, making it possible to differentiate ropy from non-ropy strains. This probe could be used directly in colony hybridization. Two oligonucleotides (PF5 and PF6) were also selected for PCR experiments. A plasmid fragment from the ropy strains was specifically amplified. PCR was performed using whole cells from laboratory cultures and preliminary results obtained with a protocol for direct PCR on wine samples are presented. Wine quality depends on the availability of such detection tools. In fact, wines generally become ropy during storage in tanks, barrels and most of the time in bottles. In the latter case, no further treatment is possible. Therefore, detection of ropy strains before bottling can help the winemaker predict the risks of spoilage with ropy P. damnosus and treat the wine in time.

Résumé
La production d'exopolysaccharides (EPS) par les bactéries lactiques est un phénomène favorable à de nombreux processus industriels alimentaires. Au contraire, dans le cidre, la bière ou le vin, la synthèse d'EPS provoque une altération grave. Des souches de Pediococcus damnosus sont capables de synthétiser un -D-glucane dans le vin, à l'origine de la "maladie de la graisse " ou des "vins filants ". Chez cette bactérie, la production d'EPS est liée à la présence d'un plasmide de 5 500 pb environ. Le séquençage de ce plasmide est en cours. L'un des cadres ouverts de lecture identifié pourrait coder une protéine dont la séquence contient des motifs conservés de glycosyltransférases. Elle est aussi très similaire à la séquence de la glucosyltransférase de Streptococcus pneumoniae type 37, produisant le même glucane que celui des souches de P. damnosus isolées du vin. La séquence du plasmide a permis l'élaboration d'outils pour la détection des souches d'altération des vins. Une sonde, ciblant le gène potentiel de la glucosyltransférase permet de différencier les souches de P. damnosus productrices de glucane des souches n'en produisant pas. D'autre part, deux amorces nucléotidiques qui amplifient spécifiquement une région du plasmide porté par les souches productrices d'EPS ont été sélectionnées. Elles sont utilisables pour des réactions de PCR réalisées directement sur la microflore présente dans le vin. La maladie de la graisse se déclare le plus souvent lors de la conservation des vins en bouteille, alors qu'il est trop tard pour envisager tout traitement. Les outils de détection utilisés sur des échantillons de vins en cuve permettront de sensibiliser le vinificateur sur les risques que présente son vin quant à l'apparition de souches de P. damnosus d'altération et de prévoir les traitements en conséquence.

Key words: exopolysaccharide (EPS) / Pediococcus damnosus / plasmid / detection / wine

Mots clés : exopolysaccharide (EPS) / Pediococcus damnosus / plasmide / détection / vin

Correspondence and reprints: Aline Lonvaud-Funel Tél. : (33) 5 56 84 64 66 ; fax : (33) 5 56 84 64 68 ; e-mail : aline.lonvaud@oenologie.u-bordeaux2.fr

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