Milk fermentation by Lactococcus lactis with modified proteolytic systems to accumulate potentially bio-active peptides

Abstract
The proteolytic system of lactic acid bacteria has been characterised in detail and numerous modified strains with null or increased specific proteolytic activities have been constructed or identified among natural strains. Based on this knowledge, our objective was to ferment milk with modified strains and produce mixtures of peptides with specific features corresponding to potential bio-activities. We used a collection of Lactococcus lactis negative mutants for peptidase activities available in the laboratory to ferment the milk. In particular, we focused our work on mutants lacking either aminopeptidase N, X-prolyl dipeptidyl aminopeptidase or tripeptidase in order to test their ability to form peptides with immunomodulating or anti-hypertensive activities. At the end of fermentation, supernatants were fractionated by RP-HPLC. Each fraction collected was analysed by Maldi-Tof MS and sequencing. We observed that mutants accumulated specific peptides consistent with the specificity of the missing peptidases. Some of the peptides identified present similarities with peptides having immunomodulating or anti-hypertensive effects. One of these was quantified. At the same time, we observed that the inhibition of angiotensin converting enzyme was stronger in supernatants obtained with mutant strains than in supernatant obtained using the wild-type strain. In conclusion, we showed that in some cases, modifications to the proteolytic system of Lactococcus lactis gave rise to significant differences in the mixtures of peptides produced during milk fermentation. The differences in bio-activity of these peptide mixtures were only partially determined in vitro and evidently need to be demonstrated in vivo. Exploitation of the biodiversity of the proteolytic system of lactic acid bacteria may enable a direct application of this work and undoubtedly a promising means of directly producing natural bio-active peptides in fermented milk products.

Résumé
Conséquences de modifications du système protéolytique de Lactococcus lactis sur l'accumulation de peptides potentiellement bio-actifs pendant la fermentation du lait. Le système protéolytique des bactéries lactiques a été caractérisé en détail et de nombreuses souches aux activités protéolytiques modifiées ont été construites ou identifiées parmi des souches sauvages. Notre objectif est de produire des mélanges de peptides ayant des activités biologiques, en utilisant ces souches modifiées pour fermenter le lait. Pour cela, nous avons utilisé une collection de mutants de Lactococcus lactis dont certaines activités peptidasiques ont été supprimées. En particulier, nous nous sommes intéressés à des souches n'ayant plus l'aminopeptidase N, la X-prolyl-dipeptidyl aminopeptidase, ou la tripeptidase pour tester leur aptitude à former des peptides ayant des activités immuno- modulatrices ou anti-hypertensives. À la fin de la fermentation, les surnageants ont été fractionnés par RP-HPLC. Les fractions collectées ont alors été analysées par spectrométrie de masse (Maldi-Tof) et séquençage. Nous avons pu constater que les mutants accumulent des peptides, dont la séquence est en accord avec la spécificité de la peptidase manquante. Certains des peptides identifiés ont des séquences proches de peptides connus comme ayant une activité immuno- modulatrice ou anti-hypertensive. L'un d'eux a été quantifié. Parallèlement, nous avons observé une augmentation de l'inhibition de l'enzyme de conversion de l'angiotensine dans les surnageants obtenus à partir des mutants par comparaison au surnageant obtenu avec la souche sauvage. En conclusion, nous avons montré que les modifications du système protéolytique de Lactococcus lactis induisent des différences notables au niveau des peptides produits pendant la fermentation. Les différences d'activité biologique observées in vitro demandent bien entendu à être démontrées in vivo. L'exploitation de la biodiversité du système protéolytique des bactéries lactiques est une application directe de ce travail et sans aucun doute une porte ouverte sur la production naturelle de peptides bioactifs dans les produits laitiers fermentés.