Lait 82 (2002) 131-144 DOI: 10.1051/lait:2001012

Survival and beneficial effects of propionibacteria in the human gut: in vivo and in vitro investigations

Gwénaël Jan^a, Pauline Leverrier^{a, b}, Isabelle Proudy^b and Nathalie Roland<sup>b

a</sup>  Laboratoire de Recherches de Technologie Laitière, INRA, 65 rue de St Brieuc, 35042 Rennes Cedex, France
^b  Standa Industrie, 68 rue R. Kaskoreff, 14050 Caen Cedex 4, France

Abstract
Propionibacteria, which are largely used as Swiss-type cheese starters, also constitute promising human probiotics because of their beneficial effects on intestinal bifidobacteria and bacterial enzyme activities. To be efficient, they must survive acid stress imposed within the stomach and the surfactant effects of bile salts. We thus investigated the ability of Propionibacterium freudenreichii (strain Propiofidus®  SI41) to adapt to, and survive these stresses. In an in vivo study, 7 volunteers received Propiofidus®  SI41 in 3 different modes. The probiotic was supplied during 3 periods (i) in classical capsules at a low dose (5 10 ⁹ CFU d ^-1), (ii) in the same capsules at a higher dose (5 10 ¹⁰ CFU d ^-1), (iii) in acid-resistant capsules at the low dose. In the first case, propionibacteria were recovered above 10 ⁵ CFU g ^-1 in only 8 out of 14 faecal samples. In the two following cases, they were enumerated in all faecal samples between 10 ⁵ and 10 ⁷ CFU g ^-1. The recovery of live propionibacteria in faecal samples seemed to be related to a higher content in short chain fatty acids. This study, which clearly showed the role of gastric protection in the survival of propionibacteria, led us to investigate stress adaptation in this strain. Acid tolerance response was evidenced: transient exposure to pH 5 afforded protection towards acid challenge at pH 2. Moreover, we showed that pre-exposure to a moderate bile salts pre-treatment at 0.2 g L ^-1 sharply increased its survival against a subsequent lethal challenge (1 g L ^-1). Important changes in cellular protein synthesis were observed during adaptation using two-dimensional electrophoresis. Global protein synthesis decreased during adaptation treatments. In contrast, specific proteins were overexpressed during acid adaptation and others during bile salts adaptation. Among the up-regulated polypeptides, a carboxyl carrier protein (BCCP) and the recombinase RecR were identified during both stress responses while the universal chaperonins GroEL and GroES, as well as the replicase RepB, were only up-regulated during acid adaptation. These results bring new insights on the tolerance of P. freudenreichii to acid and bile salts, which should be taken into consideration for the development of probiotic preparations.

Résumé
Survie et effets bénéfiques des bactéries propioniques dans l'intestin humain : études in vivo et in vitro. Les propionibactéries, qui sont largement utilisées comme levain d'affinage des fromages à pâte pressée cuite, constituent également des probiotiques humains prometteurs du fait de leurs effets bénéfiques sur la flore bifide et les activités enzymatiques bactériennes, au niveau de l'intestin. Pour être efficaces, elles doivent survivre au stress acide subi dans l'estomac et à l'action détergente des sels biliaires. Nous avons donc étudié la capacité de Propionibacterium freudenreichii (souche Propiofidus®  SI41) à s'adapter et à survivre à ces stress. Dans une étude in vivo, 7 volontaires ont reçu Propiofidus®  SI41 selon 3 modalités. Le probiotique était fourni pendant 3 périodes (i) dans des gélules classiques à une faible dose (5 10 ⁹ UFC j ^-1), (ii) dans les mêmes gélules à une dose plus élevée (5 10 ¹⁰ UFC j ^-1), ou (iii) dans des gélules acido-résistantes à la plus faible dose. Dans le premier cas, les propionibactéries ont été retrouvées à plus de 10 ⁵ CFU g ^-1 dans seulement 8 échantillons fécaux sur 14. Dans les deux cas suivants, elles ont été détectées dans tous les échantillons à une concentration comprise entre 10 ⁵ and 10 ⁷ UFC g ^-1. La présence de propionibactéries viables dans les échantillons fécaux semblait reliée à une concentration plus élevée d'acides gras à courte chaîne. Cette étude, qui montre clairement le rôle de la gastro-protection vis-à-vis de la survie des bactéries, nous a amenés à rechercher l'adaptation au stress chez cette souche. L'acquisition de tolérance en réponse au stress acide a été mise en évidence : l'exposition transitoire à pH 5 protège d'une épreuve acide à pH 2. De plus, la pré-exposition à une dose modérée de sels biliaires (0,2 g L ^-1) augmente nettement sa survie lors d'une épreuve létale (1 g L ^-1). Des modifications importantes de la synthèse des protéines cellulaires ont été observées par électrophorèse bidimensionnelle durant l'adaptation. La synthèse protéique globale diminue pendant les traitements d'adaptation. En revanche, des protéines spécifiques sont sur-exprimées pendant l'adaptation à l'acidité et d'autres pendant l'adaptation aux sels biliaires. Parmi les polypeptides sur-exprimés, une carboxyl carrier protein (BCCP) et la recombinase RecR ont été identifiées dans les deux réponses alors que les chaperonines universelles GroEL et GroES ainsi que la réplicase RepB sont seulement induites par l'adaptation acide. Ces résultats apportent de nouvelles données sur la tolérance de P. freudenreichii aux stress digestifs, qui doivent être prises en considération pour la mise au point de préparations probiotiques.

Key words: Propionibacterium / probiotique / stress / adaptation / protéome

Mots clés : Propionibacterium / probiotique / stress / adaptation / protéome

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