DOI: 10.1051/lait:2001106

Lait 81 (2001) 115-129

Étude des gènes dupliqués de la glycolyse chez lactococcus lactis il1403

Emmanuel Jamet^{a, b}, S. Dusko Ehrlich^a, Florence Duperray^b and Pierre Renault<sup>a

a</sup>  Laboratoire de Génétique Microbienne, INRA, domaine de vilvert, 78352 Jouy-en-Josas cedex, France
^b  CIRDC DANONE, 12 rue de Galilée, 92350 Le plessis-Robinson, France

Abstract
Study of the duplicated glycolytic genes in Lactococcus lactis IL1403. The conversion of sugars into lactic acid is the main metabolic pathway providing energy to lactic acid bacteria. This conversion is also involved in production of different compounds participating to the organoleptic properties of fermented products. The L. lactis knowledge of the genome has given the access to sequences of genes encoding the enzymes involved in the two main metabolic pathways described for the fermentation of glucose in lactic acid bacteria: (1) the homofermentative pathway through glycolysis leading to two lactate molecules per glucose consumed; (2) the heterofermentative pathway through the Pentose Phosphate pathway giving one lactate, one acetate and one CO₂ per molecule of glucose. The research of the genes, corresponding to proteins involved in these metabolic pathways, revealed that some enzymes are encoded by 2 distinct genes. This fact could give to the cell the possibility to produce enzymes with different biochemical properties, or to control their expression according to specific conditions. two copies of genes potentially encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (gap) and enolase (eno) have been identified. Other microorganisms such as E. coli and B. subtilis also possess 2 gap genes sharing up to 60% homology, but having different functions. In L. lactis, gap1 and gap2 genes share around 80% identity at both the nucleotidic and protein level. The analysis of codon usage, the transcription and the effect of genes inactivation shows that gap1 is the only gene involved in glycolysis. The transcription of this essential gene is very high during all phases of growth. Low increase of the level of transcription could be evidenced during growth in glucose, a sugar inducing the Catabolite Repression. Moreover, the presence of potential fixation site for CcpA (Cre box) upstream of initiation transcription box -35 suggests that gap1 transcription is activated by this protein. In contrast, the gap2 gene is dispensable and expressed at a very low level in our experimental conditions. Finally, in opposition to GapB from B. subtilis, the product of L. lactis gap2 might not to be involved in the neoglucogenesis. enoA and enoB genes are coding for proteins sharing 55% identity with known enolase. In opposition to the gap genes, the eno genes does not share significant nucleotidic homologies together. However, enoA presents 87% identity with the enolase genes from sequenced Streptococcus species whereas enoB presents 95% identity with a plasmidic encoded gene isolated from Streptococcus thermophilus. These observations suggest that enoB was transferred from species to other. The analysis of codons bias strongly suggests that EnoA is the main glycolytic enolase. The transcription of these two genes is high during the exponential growth, 2 folds higher in glucose for enoA and similar during glucose or galactose fermentation for enoB. enoA and enoB seem transcribed simultaneously during the growth. These results suggest that both genes may play a significant role in the glycolysis.

Résumé
La conversion des sucres en acide lactique est la principale voie métabolique fournissant l'énergie aux bactéries lactiques. Cette conversion est également impliquée dans la production de différents composés participant aux propriétés organoleptiques des produits fermentés. Deux voies métaboliques ont été décrites pour la fermentation du glucose chez les bactéries lactiques : (1) la voie homofermentaire ou glycolyse qui conduit à la formation de deux molécules de lactate par molécule de glucose ; (2) la voie hétérofermentaire par la voie des pentoses phosphates donnant un lactate, un acétate et une molécule de CO₂ par molécule de glucose. La recherche des gènes correspondant aux protéines nécessaires au fonctionnement de ces voies métaboliques a parfois révélé que certaines enzymes pouvaient être codées par deux gènes distincts. En théorie, cela donne la possibilité à la cellule de produire des enzymes aux propriétés biochimiques différentes ou de contrôler leur expression en fonction de conditions spécifiques. Ainsi des gènes codant de possibles glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogènases et énolases sont présents en deux copies chez L. lactis. D'autres micro-organismes comme E. coli ou B. subtilis possèdent également deux gènes gap homologues entre eux à environ 60 % , mais dont la fonction diffère. Chez L. lactis, les gènes gap1 et gap2 présentent environ 80 % d'identité nucléotidique et protéique. L'analyse des biais de codons, de la transcription et de l'effet de l'inactivation de ces gènes montrent que seule Gap1 est impliquée dans la glycolyse. La transcription de ce gène essentiel est très forte durant toutes les phases de la croissance. Une faible augmentation de son expression a été mise en évidence lors de croissance en glucose, sucre induisant la répression catabolique. De plus, la présence d'un site de fixation potentiel de la protéine CcpA (boite Cre), en amont de la boite d'initiation de la transcription -35, suggère une activation de la transcription de ce gène par cette protéine. Au contraire, le gène gap2 est dispensable et n'est quasiment pas transcrit dans nos conditions expérimentales. Enfin, contrairement à l'enzyme GapB de B. subtilis, le produit du gène gap2 de L. lactis ne semble pas être impliqué spécifiquement dans la néoglucogénèse. Les gènes enoA et enoB codent des protéines présentant 55 % d'identité avec l'ensemble des énolases caractérisées. Ces deux copies, contrairement aux gènes gap, ne possèdent qu'une très faible homologie entre elles. Cependant, enoA partage 87 % d'identité avec les gènes énolases des Streptocoques et enoB environ 95 % avec un gène codant une énolase plasmidique chez Streptococcus thermophilus. Ces observations suggèrent qu'enoB aurait été transféré d'une espèce à l'autre. L'analyse des biais de codons suggère fortement qu'EnoA soit l'énolase glycolytique principale. La transcription de ces deux gènes est forte au cours de la phase exponentielle, deux fois plus forte lors d'une fermentation en glucose comparé au galactose pour le gène enoA et semblable pour le gène enoB. enoA et enoB semblent transcrits simultanément au cours de la croissance. Ces différents résultats suggèrent que les deux gènes pourraient contribuer significativement à la glycolyse.

Key words: Lactococcus lactis / metabolism / glycolysis / regulation

Mots clés : Lactococcus lactis / métabolisme / glycolyse / régulation

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