DOI: 10.1051/lait:2001109

Lait 81 (2001) 19-28

Expression protéique, protéome Caractérisation des facteurs d'hôtes affectant la sécrétion de protéines hétérologues chez Lactococcus lactis

Philippe Langella, Sébastien Nouaille, Jacqueline Commissaire, Alexander Bolotine, Alexandra Gruss and Yves Le Loir

Génétique Appliquée, URLGA-INRA, 78352 Jouy-en-Josas Cedex, France

Abstract
Characterization of host factors affecting heterologous protein secretion in Lactococcus lactis . Lactococcus lactis is the model organism for Lactic Acid Bacteria (LAB) and is a GRAS bacterium. It is therefore a good candidate for the secretion of heterologous proteins of therapeutic interest. In order to investigate new potential uses for LAB, we study host factors involved in the production, the stability and/or the secretion of heterologous proteins in L. lactis. Our strategy uses a random insertional mutagenesis performed on a L. lactis MG1363 derivative strain carrying a uspnuc cassette in its chromosome. The uspnuc cassette encodes a hybrid precursor composed of the signal peptide of the Usp45 secreted protein and the staphylococcal nuclease (Nuc) which is used here as a reporter protein for the secretion process. Nuc activity of bacterial colonies is readily detectable in vivo and this provides an efficient screening for the selection of secretion mutants. We thus selected and analyzed six L. lactis mutants affected in Nuc secretion. Five out of the 6 corresponding genes were identified. Three of them seem to be involved in the production and/or secretion of proteins: 2 genes are homologous to unknown peptidases and one is homologous to a gene located downstream of a transcription regulator. Combination of different strategies should provide new insight of the secretion process in L. lactis and could result in the construction of secretion mutants with enhanced capacities.

Résumé
Lactococcus lactis, bactérie lactique modèle, présente une parfaite innocuité hygiénique. Elle constitue, de ce fait, un bon candidat pour la sécrétion de protéines d'intérêt thérapeutique. Une partie de nos travaux dans ce domaine concerne la caractérisation des facteurs d'hôte impliqués dans la production, la stabilité et/ou la sécrétion de protéines hétérologues chez L. lactis. La stratégie employée consiste en une mutagenèse par transposition aléatoire sur le chromosome. Cette mutagenèse est menée sur une souche de L. lactis portant une cassette uspnuc intégrée sur le chromosome. La cassette uspnuc code pour un précurseur hybride composé du peptide signal d'Usp45, protéine sécrétée par L. lactis, et de la partie mature de la nucléase de Staphylococcus aureus (Nuc) utilisée ici comme protéine rapporteur de la sécrétion. L'activité de Nuc, facilement détectable in vivo sur les colonies bactériennes, constitue un crible efficace pour la sélection de mutants affectés dans la sécrétion. Six mutants de L. lactis affectés dans la sécrétion de Nuc ont ainsi été sélectionnés et analysés. Cinq des 6 gènes correspondants ont été identifiés. Trois semblent particulièrement impliqués dans la production et la sécrétion de protéines : 2 sont homologues à des gènes de peptidases inconnues et un est homologue à un gène situé dans une région potentiellement régulatrice d'un facteur de transcription. Différentes approches par mutagenèse devraient déboucher sur une meilleure connaissance de la machinerie de sécrétion de L. lactis et la construction de mutants hyperproducteurs ou hypersécréteurs.

Key words: Lactococcus lactis / secretion / heterologous protein / random mutagenesis

Mots clés : Lactococcus lactis / sécrétion / protéine hétérologue / mutagenèse aléatoire

Correspondence and reprints: Yves Le Loir tél. : (33) 1 34 65 20 91 ; fax : (33) 1 34 65 20 65 ; e-mail : leloir@biotec.jouy.inra.fr

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