Issue Lait Volume 81, Number 1-2, January-April 2001 10th Meeting of the " Club des Bactéries Lactiques ". Page(s) 237 - 248 DOI http://dx.doi.org/10.1051/lait:2001127

DOI: 10.1051/lait:2001127

Lait 81 (2001) 237-248

Detection and identification of lactic acid bacteria in milk and industrial starter culture with fluorescently labeled rRNA-targeted peptide nucleic acid probes

Oriane Matte-Tailliez^a, Pascal Quénée^a, Recep Çibik^a, Jacques van Opstal^b, Fabrice Dessevre^a, Olivier Firmesse^a and Patrick Tailliez<sup>a

a</sup>  Unité de Recherches Laitières et Génétique Appliquée, INRA, Domaine de Vilvert, 78352 Jouy-en-Josas Cedex, France
^b  BIOCOM S.A., 24 avenue de la Baltique, Z.A. de Courtaboeuf, 91942 Les Ulis Cedex, France

Abstract
A fast and simple method for whole-cell hybridization using fluorescently labeled rRNA-targeted peptide nucleic acid (PNA) probes was developed for use in detection and identification of thermophillic lactobacilli cells growing in milk or present in industrial starter cultures. The protocol uses a filtration technique of the samples and epifluorescence microscopy as a detection system, and is completed within 1.5 h. Seven oligonucleotide probes with different ranges of specificity have been tested in in situ hybridization experiments against a number of collection and industrial strains including those of the species Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus pentosus , Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactis, Leuconostoc sp. and Streptococcus thermophilus . Certain limitations in the use of DNA probes due to non-specific hybridization were encountered and taken into account. Depending on the probe used, a specific and simultaneous detection of the different species present can be achieved. The equipment used was able to detect between 10⁴ and 10⁶ cells per mL. The physiological state of a starter cultures of thermophilic lactobacilli can also be evaluated by in situ hybridization. Thus, this fast method can be used for starter cultures and industrial fermentation quality control. This work constitutes the first reported use of PNA molecules for in situ detection and identification of bacteria in milk or in an industrial medium.

Résumé
Détection et identification des bactéries lactiques dans le lait et les levains industriels par des sondes "peptide nucleic acids " fluorescentes ciblant l'ARNr . Une méthode rapide et simple pour détecter et identifier les bactéries lactiques en croissance, au niveau cellulaire, dans le lait ou les levains industriels a été développée. Elle repose sur la technique d'hybridation de sondes fluorescentes à l'ARN ribosomique présent dans les cellules entières. Les "peptide nucleic acids " (PNA), analogues de l'ADN, ont été utilisés pour la synthèse de certaines de ces sondes. La méthode utilise aussi une technique de filtration des échantillons et la microscopie à épifluorescence. La détection et l'identification des cellules sont réalisées en une heure et demie. Sept sondes oligonucléotidiques présentant des spécificités différentes ont été testées dans des expériences d'hybridation in situ pour détecter des souches industrielles et d'autres provenant de collections de micro-organismes. Les espèces suivantes étaient représentées : Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus plantarum , Lactococcus lactis, Leuconostoc sp. et Streptococcus thermophilus. Des limites dans l'utilisation de certaines sondes ont été rencontrées à cause d'hybridations non spécifiques observées. En fonction de la sonde utilisée, une détection spécifique et simultanée des différentes espèces en présence peut être réalisée. L'équipement utilisé permet la détection d'un nombre de cellules compris entre 10⁴ et 10⁶ par mL de milieu. L'état physiologique de levains thermophiles a pu aussi être évalué par hybridation in situ. Ainsi, cette technique rapide est tout à fait adaptée pour le contrôle de la qualité des levains et des fermentations industrielles. Ce travail constitue une première description de l'utilisation de molécules de PNA pour la détection et l'identification des bactéries dans le lait et les milieux industriels.

Key words: PNA / fluorescent in situ hybridization / lactic acid bacteria / rRNA / industrial starter culture

Mots clés : PNA / hybridation in situ / bactérie lactique / ARNr / levain industriel

Correspondence and reprints: Patrick Tailliez Tel.: (33) 1 34 65 20 76; fax: (33) 1 34 65 20 65;
    e-mail: tailliez@diamant.jouy.inra.fr

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