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Volume 80, Number 4, July-August 2000
Page(s) 385 - 396
DOI: 10.1051/lait:2000133

Lait 80 (2000) 385-396

Purification and characterization of an X-prolyl-dipeptidyl aminopeptidase from Lactobacillus curvatus DPC2024

Abdallah A.A. Magboul - Paul L.H. McSweeney

Food Science and Technology Department, University College, Cork, Ireland

(Received 8 November 1999; accepted 14 February 2000)


An X-prolyl-dipeptidyl aminopeptidase (PepX) was purified $\sim 176$-fold from the cell-free extract of Lactobacillus curvatus DPC2024. The native enzyme appeared to be a dimer with a subunit molecular mass of $\sim 97.4$ kDa as determined by sodium dodecyl sulphate gel electrophoresis. Optimal activity of the purified enzyme on Ala-Pro-p-nitroanilide (pNA) was at pH 7.5 and 45 $^\circ$C. The enzyme retained more than 60% of its activity after pre-incubation for 30 min at 45 $^\circ$C but the activity decreased sharply following pre-incubation at temperatures above 45 $^\circ$C. The enzyme was activated by Co2+, Mn2+, Ni2+ at 0.1 and 1.0 mmol.L-1 and by Cu2+, Cd2+ and Zn2+ at 0.1 mmol.L-1 but it was strongly inhibited by 1.0 mmol.L-1 phenylmethylsulphonyl fluoride, Hg2+, Cu2+, Cd2+ and Zn2+ and partially by ethylenediaminetetraacetic acid, o-phenanthroline and p-chloromercuribenzoate. The enzyme hydrolysed Ala-Pro-pNA, Arg-Pro-pNA, Gly-Pro-Arg, Val-Pro-Leu at a faster rate and slowly hydrolysed Ala-Ala-pNA but it was not active on Ala-Ala-Ala, Ala-Leu-Ala, Pro-Pro-Pro, Arg-Pro-Pro, dipeptides and N-terminally blocked p-nitroanilide derivatives and other peptides. The sequence of the first 20 amino acid residues was determined and showed 40% homology to X-prolyl-dipeptidyl aminopeptidases from Lactobacillus helveticus CNRZ 32, Lactobacillus helveticus 53/7, Lactococcus lactis ssp. cremoris P8-2-47 and Lactococcus lactis ssp. lactis NCDO 763 and 35% homology to a PepX from Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis DSM 7290.

Keywords: Lactobacillus curvatus / X-prolyl-dipeptidyl aminopeptidase / purification


Purification et caractérisation d'une X-prolyl-dipeptidyl aminopeptidase isolée à partir de Lactobacillus curvatus DPC2024. Une X-prolyl-dipeptidyl aminopeptidase (pepX) a été purifiée environ 176 fois à partir d'un extrait intracellulaire de Lactobacillus curvatus DPC2024. L'enzyme native est apparue être de la forme dimère avec des sous-unités de masse moléculaire $\sim 97,4$ kDa déterminée par électrophorèse SDS-PAGE. L'activité optimale de l'enzyme purifiée, déterminée sur le fragment Ala-Pro-p-nitroanilide (pNA), a été obtenue à pH 7,5 et à 45 $^\circ$C. L'enzyme a conservé plus de 60 % de son activité après une pré-incubation de 30 min à 45 $^\circ$C mais cette activité a diminué brutalement après pré-incubation à des températures supérieures à 45 $^\circ$C. L'enzyme a eu son activité augmentée par une concentration de 0,1 et 1,0 mmol.L-1 en Co2+, Mn2+, Ni2+ mais a été inhibée fortement par une concentration de 1,0 mmol.L-1 en phénylméthylsulfonyl fluoride et en Hg2+, Cu2+, Cd2+ et Zn2+ et partiellement inhibée par l'acide éthylènediaminetétraacétique, la o-phénanthroline et le p-chloromercuribenzoate. L'enzyme a hydrolysé les fragments Ala-Pro-pNA, Arg-Pro-pNA, Gly-Pro-Arg, Val-Pro-Leu à une vitesse plus élevée et le fragment Ala-Ala-pNA à vitesse lente mais n'a pas été active sur les fragments Ala-Ala-Ala, Pro-Pro-Pro, Arg-Pro-Pro, les dipeptides, les peptides et les dérivés de p-nitroanilide bloqués du côté N-terminal. La séquence des 20 premiers acides aminés a été déterminée et a révélé 40 % d'homologie avec les X-prolyl-dipeptidyl aminopeptidases de Lactobacillus helveticus CNRZ32, Lactobacillus helveticus 53/7 et Lactobacillus lactis ssp. lactis NCDO 763, 35 % d'homologie avec la PepX de Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis DSM 7290.

Mots clé : Lactobacillus curvatus / X-prolyl-dipeptidyl aminopeptidase / purification

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